《J.Biol.Chem》具有新型催化机制的独特糖苷水解酶家族成员α-1,4-葡聚糖裂解酶的晶体结构
文摘
科学
2024-11-20 11:43
江苏
2013年7月，Henriette J. Rozeboom等人在《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》上发表了一篇题为Crystal Structure of α-1,4-Glucan Lyase, a Unique Glycoside Hydrolase Family Member with a Novel Catalytic Mechanism的研究性论文。
通讯单位：Genencor, Danisco A/S, Edwin Rahrs Vej 38, DK-8220 Brabrand, Aarhus, Denmark.
Abstract
红藻龙须菜中的α-1,4-葡聚糖裂解酶（EC 4.2.2.13）切割糖原、淀粉和麦芽寡糖中的α-1,4-糖苷键，产生酮单糖1,5-脱水-D-果糖。该酶属于糖苷水解酶家族31（GH31），但通过消除反应而不是水解来降解淀粉。晶体结构显示，该酶与GH31水解酶一样，含有一个（β/α）8羧基催化结构域，带有B和B’亚结构域，一个N-末端结构域N，以及C-末端结构域C和D。发现裂解酶的N-末端结构域N与三糖结合。该酶与阿卡波糖和1-癸炔诺霉素的复合物以及用氟化糖类似物获得的两种不同共价糖基酶中间体表明，与GH31水解酶一样，天冬氨酸残基Asp553和Asp665分别是催化亲核试剂和酸。然而，作为一个独特的特征，催化亲核试剂也可以作为从共价结合的亚位点-1葡萄糖基残基的C2碳原子中提取质子的碱基，从而解释了酶的独特裂解酶活性。Sulfolobus solfataricus同源α-葡萄糖苷酶活性位点的一个Glu到Val突变导致水解酶活性转变为裂合酶活性，这表明微妙的氨基酸差异可以促进GH31水解酶中的裂合酶活力。
糖苷水解酶（GHs）4是几乎所有生命形式中都存在的重要生物催化剂，它们催化关键的生物反应，包括寡糖和多糖的水解降解。根据它们的一级结构和保守的序列基序，它们被分为＞130个糖苷水解酶家族。然而，非水解酶，如裂解酶，也存在并切割糖苷键。多糖裂合酶（EC 4.2.2.-）通过提取C5’质子来切割O-C4’糖苷键，然后在C4’和C5’原子之间引入烯烃官能团。相比之下，α-1,4-葡聚糖裂解酶（GLases；EC 4.2.2.13）通过提取C2质子和形成烯醇形式的脱水果糖来切割糖苷C1-O键（图1）
图1. 糖苷水解酶和两种多糖裂解酶分别对糖苷键断裂的三种机制进行了比较。对于果糖酐，显示了烯醇互变异构体，由于烯醇-酮互变异构化，其以酮形式处于平衡状态。
图2.构建四个GLase表达盒。FL基因，编码全长葡聚糖裂解酶基因（1-1038）；CC基因，编码N端截短裂合酶（224-1038）；NC基因，编码C-末端截短裂合酶（1-938）；以及编码N端和C端截短裂合酶的C基因（224-938）。这些构建体用于通过电穿孔转化多形H。
基于序列相似性和C1-O糖苷键的切割，GLase被归类为糖苷水解酶家族31（GH31）的特殊成员，而不是单独的多糖裂解酶家族的成员。它们形成GH31亚组2，而亚组1包含所有已知的α-葡萄糖苷酶，包括人类溶酶体α-葡萄苷酶、内质网葡萄糖苷酶II、消化酶麦芽糖酶-葡糖淀粉酶（MGAM）和蔗糖酶-异麦芽糖酶等重要酶。亚组3和4分别含有古菌和细菌α-木糖苷酶。序列比对显示，GLases与GH31亚组1α-葡萄糖苷酶具有18-25%的同一性，与其他亚组的同一度较低。该比对进一步揭示了亚组1和2的几个特征序列的存在，其中包括基序WXDM和WXGDN。基序WXDM中的D被证明代表催化亲核试剂，而WXGDN中的D则充当酸/碱催化剂。基于动力学同位素效应的机理研究表明，糖苷酶催化的反应分两步进行。在第一步中，形成共价GLase底物中间体（糖基化GLase），这类似于由保留GH31的糖苷水解酶催化的双置换反应的第一步。第二步，提出了GLase底物中间体的合成，产生不饱和糖1,5-脱水果糖和游离酶GLase。第一和第二反应步骤都应该通过氧代卡宾离子样过渡态进行。然而，到目前为止，在消除反应中，哪个残基从糖环的C2原子中提取质子尚不清楚。GLases是从底物的非还原端起作用的外泌酶。它们可以降解麦芽低聚糖和淀粉，这表明它们的活性位点包括几个葡萄糖基结合亚位点。此外，GLases和糖苷水解酶共享某些竞争性抑制剂，如1-脱氧野尻霉素和阿卡波糖，Ki值分别为0.130μM和0.002μM。1,5-二氟糖苷也是GLase的抑制剂。此类糖在异构碳上被适当活化，具有优异的离去基团。C5氟基团增加了过渡态的能量，从而减缓了酶催化的两个反应步骤，因此这些氟糖可用于标记催化亲核试剂。在C5处倒置的母体氟糖的差向异构体似乎是GH38α-甘露糖苷酶和GH31α-木糖糖苷酶的更有效捕获试剂。事实上，对于GLase，Ki为28.3±2.1 mM的5-氟-吡喃葡萄糖苷氟化物（5FβIdoF）比表观解离常数Ki为6.5 mM的5-氟-α-D-吡喃葡萄糖氟化物（5FαGlcF）更有效。在这里，我们报告了龙须菜GLase的x射线结构，龙须菜是一种属于GH31的裂合酶，其天然形式以及与阿卡波糖、1-癸炔诺霉素、5FβIdoF和5FαGlcF的复合物。我们表明，催化亲核试剂Asp553在形成共价酶糖基中间体的反应的第一步中起亲核试剂的作用，但在第二步中起催化碱的作用，从共价结合的亚位点-1葡萄糖基残基的C2碳原子中提取质子。这些结果解决了质子提取残渣性质长期以来的模糊性。古菌α-葡萄糖苷酶同源物MalA的定点突变和酶学特征表明，细微的变化足以赋予水解酶裂解酶活性。
α-1,4-葡聚糖裂合酶的整体结构——通过分子替换解决了N末端缺失11个残基的全长G.lemaneiformis GLase的结构，并根据2.06Å的分辨率衍射数据进行了改进，R因子为0.168（Rfree=0.214），具有良好的立体化学性质（表1和图3）。尽管P1单位细胞包含4个分子，每个分子有1025个残基，但在溶液中，蛋白质是单体的，如天然PAGE分析所示。表1.数据收集和结构优化统计。数据括号中的值用于最高分辨率外形。图3. GLase的结构域显示在两个不同的方向上。各个结构域的颜色如下：N-末端结构域（结构域N）黄色；中心催化（β/α）8桶（结构域A）红色；子域B（loopAβ3→Aα3），品红色；子域B（loopAβ4→Aα4），橙色；近端C末端（结构域C），蓝色；远端C末端结构域（结构域D）为绿色。催化残留物以青色棒状显示，标记为D553和D665。每个GLase分子包含四个主要结构域，形成一个非常紧凑的结构，尺寸为93×65×49Å（图3）。GLase从N末端结构域（结构域N，残基12-332）开始，并继续催化A结构域（残基333-785）。A结构域有一个（β/α）8杆折叠，有两个插入的亚结构域B和B。该结构由近端和远端C末端结构域完成（结构域C，残基784-879，结构域D，残基880-1038）。结构域N、C和D富含片层。GLase的-片含量（28%）与圆二色性研究一致。尽管GLase中存在15个半胱氨酸残基，但它们都不形成二硫键。GLase结构的紧凑性可以解释其对蛋白水解切割的抗性。只有在延长反应时间后，蛋白酶K和枯草杆菌蛋白酶才能产生两个片段，其中分子量较大的片段从Ser175开始，表明对这些蛋白酶敏感的唯一位点是表面环173ASSG176。GLase结构与其他八个具有结构特征的GH31家族成员的结构非常相似，DALI Z评分超过30，尽管均方根偏差值＞2.7Å，序列同一性低于21%。这些蛋白质是人肠道MGAM（NtMGAM；PDB代码2QLY，CtMGAM；PDB代码3TON）、人蔗糖酶异麦芽糖酶（PDB代码3LPO）、Ruminococcus obeumα-葡萄糖苷酶（Ro-αG1；PDB代码3N04）、Sulfobbus solfataricusα-葡糖苷水解酶（MalA；PDB代码2G3M）、Cellvibrio japonicusα-木糖苷酶（CjXyl；PDB代码2XVG）和α-转葡糖苷酶（Cj Agd；PDB代码4B9Y）以及大肠杆菌α-糖苷酶（YicI；PDB代码1WE5）。大多数保守残基位于A结构域，与其重要的底物结合和催化功能一致。结构域N包含一个次级碳水化合物结合位点（SBS）——大的N端结构域折叠成双层扭曲的19链β-三明治结构（图3）。该折叠属于半乳糖变位酶样超家族，可能在作用于糖的酶中作为碳水化合物结合结构域发挥作用（见SCOP数据库）。N结构域包含与催化结构域密切相互作用的环，并容纳对活性和活性位点结构至关重要的几个不变残基。其中分别是NI、NII和NIII基序GLAE、YNVD和PMYYAAP的残基Gly212、Glu215、Asp239和Tyr266。Gly212残基的主链扭转角是其他氨基酸所不允许的（分别为115°和129°），也没有空间容纳更大的侧链。残基Glu215与其侧链氧原子之一氢键结合到残基Tyr266的骨架酰胺上，其中羟基又与残基Asp665的骨架酰胺（催化酸）形成氢键。残基Asp239直接参与底物结合（见下文）。因此，残基Gly212、Glu215和Tyr266对于稳定结构域A中活性位点的结构似乎很重要。N端氨基酸测序显示，全长G.lemaneiformis GLase在多形H.中的表达产生了一种在N端缺失11个残基的活性葡聚糖裂解酶。然而，其活性和底物特异性与野生型酶无法区分，表明11个N-末端残基对多形H.的活性和表达不是必需的。相比之下，没有观察到具有较大N端截短的变体（仅包含残基224-1038或224-938）的表达。最有可能不产生活性酶，因为这些构建体缺少稳定活性位点结构的3个残基中的2个。GLase与生淀粉结合，但与具有碳水化合物结合模块（CBMs）的酶的氨基酸序列比对没有显示出任何相似性。GLase Acr的晶体结构显示，GLase结合2个阿卡波糖分子，1个在活性位点（见下文），另一个在残基32-37和残基189-191之间的裂缝中结合到N端结构域（图4C）。后一种阿卡波糖仅与其非还原性末端缬氨酸和二脱氧葡萄糖单元结合，而与其麦芽糖部分不结合。单糖类似物脱氧雪腐霉素（GLase DNJ）和氟糖5FβIdoF和5FαGlcF的浸泡实验没有显示出与GLase N结构域的任何结合，这表明N结构域识别和结合至少需要一个α-1,4-连接的葡萄糖二糖。图4. 活性位点。A、 与1-脱氧野支睾吸虫复合的GLase（GLase DNJ）（绿色）与Fo-Fc结合在亚位点-1中，省略了3.0的电子密度。B、GLase与阿卡波糖复合物（GLase Acr）（绿色）与Fo-Fc结合在亚位点-1、+1、+2和+3中，省略了3.0的电子密度。主链和侧链的进一步颜色编码如图3所示。为清楚起见，仅显示了B中的侧链。C、 在cpk彩色棒和透明表面呈现中，阿卡波糖（绿色）结合在GLase Acr N末端结构域N的假定淀粉结合位点的图像。
已知几个糖苷水解酶家族具有与淀粉结合功能相关的CBMs。GLase的结构域N在氨基酸序列、大小和折叠以及对非还原性末端葡聚糖二糖部分的特异性方面与这些已知的CBMs不同。芳香氨基酸通常对CBMs的功能至关重要，因为它们与糖环提供π堆叠相互作用，但如图4c所示，GLase中的残基Phe33和Trp41通过范德华相互作用与阿卡波糖结合。这意味着该结合位点应被视为SBS。GH31家族成员的序列比对表明，此类SBS存在于其他藻类葡聚糖裂解酶中，真菌葡聚糖裂解酶可能存在变体形式。尽管这些发现表明GLase的结构域N包含SBS，但它在其他GH31成员中并不保守。一个可能的原因是，这种结合位点只对作用于糖原和淀粉颗粒等较大底物的蛋白质有利。结构域C和D——近端C末端结构域由一个八股反平行三明治结构组成，其中有一个310螺旋和一个插入在第一股之后的小α螺旋（αC1）。它被包装在N、A和D域之间（图3）。C5和C6之间的6个残基310螺旋在其他GH31酶中不存在，在A和D结构域之间非常稳定。GLase的159个C末端残基形成结构域D。结构域D由一个12链的大部分反平行三明治结构组成，由两条六链组成，链βD3和βD9后有两个α-螺旋，链βD1和βD11后有两条310螺旋。该结构域与结构域C和A有主要的相互作用，特别是通过螺旋αD1和αD2。缺失C末端100个残基的截短型GLase变体（1-938）的表达显示出活性，尽管减少了10-20倍，表明100个C末端残基对多形H.的活性和表达不是必需的。其他GH31成员包含类似的D域。结构域A和活性位点结构——催化结构域A由一个（β/α）8桶（TIM桶）和两个额外的螺旋，αA’和Aα8’组成。另外两个结构域B（残基462-530）和B（残基556-615）分别插入A3和A4之后（图3）。亚结构域B（一个3链片和一个α-螺旋）的二级结构元素与其他GH31成员NtMGAM、CtMGAM、Ro-αG1、蔗糖酶异麦芽糖酶、CjAgd和MalA中的相同，但在GLase中，片更长，更靠近活性位点。子域B中的额外环（残基490-504）与N末端和子域B’相互作用。GLase的活性位点位于结构域A的（β/α）8桶的C末端。链βA1、βA6、βA7和βA8之后的环的残基形成了活性位点。此外，来自N域（243-262）、B域（512-518）和B域（559-590）的环路构成了活动位点的入口（图3）。催化亲核试剂Asp553位于链A4的末端。残基Asp553和Asp665的羧酸氧原子之间的距离为5.8Å，这使得残基Asp665可能是酸/碱催化剂。这个距离与保留糖苷水解酶的距离相似，为5.5Å。在天然GLase的结构中，来自冷冻保护剂的2个甘油分子（已知通常模仿糖底物）结合在活性位点。亲核试剂Asp553与残基Arg649、Asn459、甘油分子的O2原子和2个水分子氢键结合。酸/碱Asp665与3个水分子和第二甘油分子的O1原子相互作用。活性位点附近-片C末端的残基分别包括-链A1至A8的Phe373、Asp412、Asn459、Asp553、Arg649、Trp662、Asp694和His731。它们与残基Trp551、Met554、Phe698、Arg729和Tyr513一起形成亚位点-1。-1子位点的狭窄入口形成了一个真正的口袋，主要由残基Phe373、Tyr513、Met554、Arg649、Asp665和Phe698形成。GLase活性位点口袋的整体轮廓与GH31成员MalA、NtMGAM、CtMGAM、蔗糖酶、Ro-G1、CjAgd、CjXyl和YicI的轮廓相似。然而，观察到残基Phe373、Val413、Asn459、Thr461和Tyr513的氨基酸替换。残基Tyr513位于亚结构域B中，是额外环的一部分，与其他糖苷酶GH31成员中位于同一位点的Trp残基有显著不同。Asn459与相邻的亲核试剂Asp553形成氢键。GH31的糖苷酶成员中不存在这种氢键，其中存在Ile残基或较小的Ser残基。1-脱氧野尻霉素和阿卡波糖-1-脱氧野尻霉素的结合是通过氢键在亚位点-1结合的（图4A），阿卡波糖是吡喃糖环中具有氮原子而不是氧原子的葡萄糖类似物。1-脱氧野尻霉素的羟基与残基Asp665、Arg649、His731、Asp412、Asp553、Asn459和2个水分子形成氢键。残基Phe698、Phe373、Tyr513、Trp551和Trp662提供疏水相互作用。阿卡波糖与GLase的-1至+3亚基结合，缬氨酸残基与-1亚基结合、6-脱氧葡萄糖残基与+1亚基结合以及麦芽糖亚基与+2和+3亚基连接。阿卡波糖在N-糖苷键处有点扭曲的构象，破坏了亚位点-1中的糖OH2基团和亚位点+1中的糖OH3基团之间的氢键，如图4B所示。阿卡波糖缬氨酸胺部分在亚位点-1的相互作用与1-脱氧野尻霉素和GLase复合物中表现出的相互作用相似。与C1结合的氮原子位于两种催化天冬氨酸盐之间，它模拟了α-1,4键中的糖苷氧原子。残基Asp665-OD2与氮原子形成氢键，这将是糖苷氧质子化的理想方向。阿卡波糖在亚位点-1的结合与NtMGAM、CtMGAM和CjAgd中的阿卡波糖结合惊人地相似。碳水化合物结合亚位点+1、+2和+3—对于亚位点+1，残基Arg649、Asp239和Met553与阿卡波糖6-脱氧葡萄糖单元的OH3基团相互作用。OH2基团与残基Asp239的OD1和OD2具有氢键。这些氢键弥补了缬氨酸部分的OH2基团和阿卡波糖6-脱氧葡萄糖单元的OH3之间氢键的损失。残基Asp239在GH31成员中是保守的，并且总是位于N末端结构域。这些相互作用与NtMGAM阿卡波糖复合物中的相互作用基本相似。改变Ro-αG1中Asp239的等效残基会消除酶活性，表明其重要性。在CjXyl和CjAgd中，Asp239的作用被Glu接管，Glu存在于CjXylN末端结构域的PA14结构域插入和CjAg的B’结构域中。当α-1,4-葡聚糖结合时，在与双脱氧葡萄糖单元中缺失的OH6基团匹配的位置，有足够的空间使O6与残基Tyr513的骨架羰基形成氢键。+1糖环堆叠在由残基Tyr513（其他GH31家族成员中的Trp）和残基Met554（其他成员中的Met，CjXyl中的Ala、CjAgd中的Leu和YicI中的Phe除外）的侧链形成的疏水垫上。在GH31家族的糖苷水解酶成员中，513位的Trp残基严格保守，而在GLase中，它被Tyr残基取代。残基Leu241的侧链与亚位点+1、+2和+3的糖环发生疏水相互作用（图4B）。在亚位点+2，残基Gln245与阿卡波糖葡萄糖单元的OH2基团相互作用，凹槽相对位置的残基His741与OH6基团相互作用。在亚位点+3，底物和GLase之间没有相互作用（图4B）。阿卡波糖的结合完全保护了亚基-1免受溶剂的侵害。NtMGAM中的Thr205残基和MalA中的Gly89残基为水解反应中使用的水分子提供了进入空间，而GLase中的Leu241残基则阻止了水分子的进入（图4A）。GH31家族的所有水解酶在此位置都有一个小的或亲水的氨基酸，而裂合酶则有一个较大的疏水氨基酸（Leu或Met）。虽然蔗糖酶异麦芽糖酶在这个位置也有一个亮氨酸，但它位于距离Leu241 2.5Å的位置，从而产生了更开放的+1至+3亚位点。α-转葡糖基化酶CjAgd也通过由2个酪氨酸残基形成的疏水性“糖”钳与阿卡波糖有很强的相互作用。在CjXyl中也观察到由2个Trp残基组成的类似钳位。1-脱氧野尻霉素和阿卡波糖（GLase抑制剂）的结合如方案1的第二张图片所示。方案1.α-1,4-葡聚糖裂解酶的反应机理。
GLase的底物特异性—与GH31α-木糖苷酶相比，GLase的YicI和CjXyl亚位点-1具有更大的空间，使其能够容纳α-1,4-葡聚糖的羟甲基。事实上，YicI的双突变C307I/F308D旨在增加活性位点的空间，将木糖苷酶转化为α-葡萄糖苷酶。此外，GLase中存在的碳水化合物结合+2亚位点使酶能够作用于较长的α-1,4-葡聚糖，这与MalA相反，MalA中没有+2亚位点，因此更喜欢短的二糖底物麦芽糖。最后，GH31糖苷水解酶Ro-αG1更喜欢α-1,6-而不是α-1,4-连接的底物。这种偏好可以通过一个W169Y突变来切换，该突变为结合在亚位点+1的α-1,4-连接葡萄糖的6-羟基腾出空间。在GLase中，等价残基是苯丙氨酸（Phe373），它也为+1亚位糖残基的6-羟基提供了空间，这与酶对α-1,4-连接糖苷的严格偏好是一致的。5FαGlcF和5FβIdoF与GLase共价结合——用基于机制的抑制剂5FαGlcF及其C5差向异构体5FβIdoF浸泡GLase晶体，发现这些化合物在四种单体中的三种中通过β糖苷键与Asp553共价结合。然而，在单体D中，它们发生了反应，因为与Asp553的共价键和C1处的氟原子没有电子密度（图5）。事实上，具有平面O5-C1-C2-O2-C3构象的产物5F脱水果糖（或其C5差向异构体）可以与单体D活性位点的密度相匹配。在目前的分辨率下，无法区分产物的1,2烯醇和酮形式，但我们已经对keto-5-Fanhydrofructose进行了建模（图5）。图5. 立体图比较了单体A共价中间体（绿色/青色）中5F Glc的结构，单体D中5F果糖酐/产物（橙色）的结构，以及5FIdo单体中5F果糖脱水/产物（板蓝色）的结构。5FαGlc和5FβIdo在C5的氟位置不同。在葡萄糖中，氟原子位于轴向，并与Phe698发生范德华相互作用。葡萄糖O6羟基与Asp412的OD2原子处于氢键距离处。相比之下，糖中的氟原子是等位的，并与Asn459的ND2相互作用。糖的O6与甘油分子和水分子形成氢键。糖的不同氢键相互作用可能解释了这种化合物对酶的更高亲和力和抑制力。共价结合的氟糖除了C1和C2原子外，与脱氧雪腐镰刀菌素具有相似的相互作用。它们的构象从正常的松弛4C1构象（具有赤道糖苷键）扭曲为1S3斜舟构象，其中糖苷键为假轴（图5和图6）。斜船构象允许Asp553的OD1羧基氧更接近-1葡萄糖的C2原子，这在葡萄糖的4C1构象中是不可能的（见方案1的第三张图片）。这种构象畸变和羰基氧与葡萄糖C2原子之间的短距离对催化机制有重要影响（见下文）。图6. 模拟退火的立体图忽略了与Asp553结合的5FβIdo（黄色）的电子密度。单体A的密度如图所示，其轮廓为3。为了清楚起见，只显示了与共价结合糖的氟原子和C2-OH羟基相互作用的侧链。5FαGlc抑制剂以与CjAgd相同的构象结合（PDB代码4BA0）。在这两种结构中，被捕获的5FαGlc分子与亲核试剂的OD2共价连接。-1口袋中的一个显著差异是Asn459，它与Asp553形成氢键，而在CjAgd中，这个残基是疏水性异亮氨酸，就像GH31的所有其他糖苷酶成员一样。催化机理——GLase与各种结合抑制剂的晶体结构表明，底物与其非还原端在亚位点-1结合，并向+n亚位点延伸。这种结合模式与生化实验一致，表明GLase从非还原端降解多糖。已知1-脱氧野尻霉素和阿卡波糖通过模拟氧卡宾离子样过渡态结构来抑制葡聚糖水解酶。在葡聚糖裂合酶中，它们可能以相同的方式发挥作用，因为反应的第一步，即通过氧碳烯离子样过渡态形成共价酶-底物中间体，与GH31裂合酶和水解酶相同。在GLase中，这一第一步是由Asp665侧链催化的，它充当一种通用的酸催化剂，使剪切键的糖苷氧质子化。同时，亲核试剂Asp553的一个羧酸氧原子攻击与亚位点-1结合的底物糖基残基的C1碳，产生共价结合的糖基酶中间体（方案1和图5和图6）。对于第二步反应，即去糖基化，Lee等人根据动力学同位素效应测量提出了E1样E2协同机制。这意味着，在异头中心，糖苷C-O键大部分断裂，产生了一种具有高度发达的氧碳正离子特征的物种，从而酸化了C2质子，并允许其在反应坐标后期相对容易地去除。如共价结合的5FαGlcF和5FβIdoF的结构所示，亲核试剂Asp553的羰基氧原子正确定位，可以从糖C2碳原子中提取质子。我们提出的机制类似于通过C2质子的顺加成（顺消除的相反）保留糖苷酶催化糖基底物水合的机制。在这些酶中，亲核试剂也被认为参与质子转移。Yu等人以及Yip和Withers分别认为酸/碱催化剂Asp665和亲核试剂Asp553在质子提取中具有双重作用。此外，有人提出活性位点中可能存在单独的碱基B-或水分子激活的Asp665。酸催化剂Asp665位于环的相对侧，因此不能从C2中提取质子，也没有合适的水分子。在活性位点中没有观察到能够提取质子的单独碱基。Arg649与糖的O2形成氢键，并且也没有正确定位。Asn459的位置正确，但4.6Å距离C2太远，无法提取质子。相反，Asn459向亲核试剂Asp553的相邻羧酸盐（酯氧）提供氢键。在5FαGlcF实验的单体D中，一旦共价中间体被释放，这种键就会变短。Asn459可能通过调节亲核试剂的位置和电荷在第二过渡态稳定中起着关键作用。Arg649在所有GH31酶中都是严格保守的。在GH31水解酶成员中，这种精氨酸与556位保守的Glu具有盐桥相互作用，但在GH31裂合酶中，与Glu556等价的残基是Val或Thr。在GLase中，Arg649与结合在亚位点+1的葡萄糖的OH3原子和催化亲核试剂Asp553的OD1原子形成氢键。这些相互作用表明，Arg649不仅对底物识别很重要，而且可能在调节Asp553的电离状态方面发挥作用。精氨酸侧链处于Tyr266、Trp662、Met554和Val556侧链赋予的非极性环境中，这降低了其胍基的pKα，使其能够吸收Asp553从糖中提取的质子。随后，在产物离开活性位点后，该质子可以通过Asp239中继到溶剂或中继到催化酸Asp665进行下一个催化循环。事实上，在5FIdoF实验的单体D中，Arg649胍基团向D553 OD1旋转了约25°，从而将到D553 OD2的距离从3.4Å减小到2.9Å。这表明残基556（Glu或Val）是GH31酶水解酶与裂解酶反应特异性的主要决定因素。α-葡萄糖苷水解酶活性向裂合酶活性的转变——如上所述，556位氨基酸残基的性质（Val/Thr与Glu）对GH31酶的反应和产物特异性非常重要。这一观点的支持来自对粟酒裂殖酵母GH31α-葡萄糖苷酶的动力学研究，该研究表明，相当于GLase（E484A）Val556的残基突变消除了其水解酶活性，但该酶在D-葡糖醇上保留了5%的水合活性，通过C2质子化产生2-脱氧-D-葡萄糖（GLase的逆反应）。为了证明556位残基对裂解酶活性的重要性，将E323V突变（GLase中的Val556）引入古菌GH31α-葡萄糖苷酶MalA。我们使用了MalA的三重突变体（I213V/I249N/D251T；GLase V413N459T461），该突变体已经大大降低了水解酶活性，但无法形成脱水果糖。部分纯化的三重突变体的比活性为0.012±0.004μmol/min/mg蛋白质，而部分纯化的野生型MalA的比活性则为0.362±0.005μmol/min/mmg。对于四重MalA突变体（I213V/I249N/D251T/E323V），表达的蛋白质在HisTrap纯化后形成（可溶性）聚集体。通过在22°C下储存蛋白质并去除咪唑，凝胶过滤可以分解约450 kDa的MalA蛋白质，这与之前描述的分子量相似。四重突变体在高蛋白浓度和延长反应时间后显示出可检测的裂合酶活性（图7），而它完全失去了葡萄糖苷酶活性。因此，MalA中的E323V突变将反应转向裂解酶活性，证明了323（556）位对水解酶/裂解酶活性的重要性，这可能是通过调节活性位点中完全保守的精氨酸的构象来实现的。将MalA进化为具有类似于GLase的Kcat的真正裂解酶将需要进一步的突变研究。
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图7. 反相高效液相色谱分析的色谱图。标示的是GLase和MalA四重突变体在麦芽糖上的反应产物，AF是纯的1,5-脱水-D-果糖。在进行HPLC之前，糖用O-乙基羟胺衍生化。四重MalA突变体的反应时间为90小时；对于野生型GLase，在21°C下30分钟。基于HPLC分析峰面积的计算表明，MalA突变体具有0.029 nmol AF min-1 mg-1的活性和2.9μmol AF min-1 mg-1的野生型GLase活性。在21°C下，四重突变体的野生型GLase活性为0.001%（约低100000倍）。衍生化AF的保留时间为7.69ml。MalA突变体的进一步详细动力学表征仍有待完成。
GH31的所有四个亚组的结构现已确定。有趣的是，尽管三维结构和催化位点结构非常相似，并且基本的催化残基完全保守，但GLase与GH31葡聚糖水解酶相比显示出非常不同的反应特异性。我们的结果表明，反应的第一步，共价酶底物中间体的形成，确实是保守的。然而，葡萄糖基中间体不像GH31水解酶那样水解，但活性位点556位的Val而不是Glu的微妙变化现在促进了裂合酶反应。因此，裂合酶中的亲核试剂具有双重功能，也可以作为碱，从-1葡萄糖残基的C2原子中提取质子。因此，大自然选择了一种简单的方法，通过在活性位点环境中的局部区域进行巧妙的变化来进化新的酶活性。
原文：Crystal Structure ofα-1,4-Glucan Lyase, a Unique Glycoside Hydrolase Family Member with a Novel Catalytic Mechanism.DOI:
https://doi.org/10.1074/jbc.M113.485896
