近期，深圳大学第一附属医院黄卫人团队在《Journal of Controlled Release》期刊2024年第366期上发表了题为“Modulating the tumoral SPARC content to enhance albumin-based drug delivery for cancer therapy”的研究文章。提升药物的实体瘤靶向性一直是领域内的研究热点，然而开发高效的肿瘤靶向药物递送载体研究难度大，成功转化产品寥寥。研究者引入合成生物学的研究策略，以人血清白蛋白为模式载体，将优化重心从白蛋白载体本身转移至富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（Secreted protein acidic and rich in cysteine, SPARC），一种能够与人血清白蛋白高亲和性结合的肿瘤基质糖蛋白，设计开发了一种具有肿瘤细胞识别响应特性的SPARC基因调控元件，将其包载于白蛋白载体上。该设计使白蛋白载体具备主动感知识别肿瘤细胞的能力，能通过特异性提高肿瘤SPARC含量，显著增强白蛋白载体药物的肿瘤靶向递送。该研究为提高药物的肿瘤递送效率提供了新的研究思路和策略。人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）是一种分子量为 66 kDa的高丰度血浆蛋白质，因其良好的组织靶向性和生物相容性已被开发作为药物载体的支架或靶头广泛用于药物的体内递送。其中最成功的应用当属白蛋白结合型紫杉醇纳米制剂（Abraxane, ABR），已获批用于治疗转移性乳腺癌和胰腺癌。几项临床研究报道SPARC 阳性肿瘤或SPARC高表达患者在接受含 ABR 的治疗后具有更长的总生存期和更高的响应率。SPARC 是一种基质细胞糖蛋白，可与HSA高亲和性结合。尽管此现象在不同肿瘤类型之间可能存在差异，但普遍认为，ABR 中HSA与肿瘤组织中 SPARC 的结合增加了 ABR 在肿瘤中的富集，从而增强了 ABR 的抗肿瘤效果[1-3]。鉴于白蛋白载体肿瘤递送效率与肿瘤SPARC水平之间的相关性，研究者提出采用一种肿瘤选择性的CRISPR激活方式特异性提高肿瘤中SPARC含量，通过主动干预肿瘤微环境的方式，以改善白蛋白药物肿瘤靶向递送的治疗策略。首先设计了一种具有NF-κB响应特性的SPARC基因调控元件，通过对靶向SPARC启动子区的sgRNA（sgSPARC）工程化改造，在其骨架序列加入抗NF-κB的适配体RNA（sgSPARC-ap），并与具有转录激活活性的dCas9-VP64蛋白形成核糖核蛋白复合物而得。将SPARC基因调控元件包载于阳离子化白蛋白载体（SP-NPs）上，使SP-NPs能够通过识别肿瘤细胞高度活跃的NF-κB转录因子以区分肿瘤/非肿瘤细胞，进而特异性上调肿瘤细胞的SPARC表达。研究者推测，尽管经血管到达肿瘤部位的SP-NPs初始浓度可能相对较低，但它可以感知识别肿瘤细胞，通过选择性增加肿瘤细胞中的SPARC表达来建立更有利于白蛋白载体富集和渗透的肿瘤微环境，而后续进一步富集的SP-NPs又反过来能作用更多的肿瘤细胞，再次提高肿瘤中SPARC含量。因此，通过多次给药，可建立“HSA-SPARC”正反馈循环放大效应，逐步实现对肿瘤组织SPARC含量的定向调控，有效提高白蛋白载体的肿瘤递送效率（图1）。
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图1. 寡肽修饰的工程化外泌体用于脑胶质瘤药物递送治疗
研究者首先对CRISPR/dCas9-VP64基因调控系统的sgRNA进行工程化改造，使其不仅能靶向SPARC的启动子区，还整合了与NF-κB结合的适配体序列。这种核糖开关的设计使得sgSPARC-ap在与NF-κB结合前后能够发生构象转变，从而像开关一样，根据NF-κB的活性来决定是否上调SPARC基因表达。在非肿瘤细胞中，NF-κB在细胞核内的活性相对较低， sgSPARC-ap与NF-κB的结合机会较少。此时，sgSPARC-ap的引导区序列与适配体中的互补配对序列相结合，使其无法靶向至SPARC启动子区，因此sgSPARC-ap处于非活跃的“关闭”状态。而在高NF-κB活性的肿瘤细胞中，sgSPARC-ap的适配体序列能与NF-κB结合，引发sgSPARC-ap的空间构象转变，并释放出引导区序列与SPARC启动子区相结合上调其表达。此时，sgSPARC-ap便切换到了活跃的“启动”状态。体外细胞刺激实验证实，sgSPARC-ap对膀胱癌细胞系SPARC的mRNA和蛋白质水平的上调作用存在浓度和时间依赖性，且该上调作用还依赖于细胞系NF-κB的活性水平，与其呈正相关关系；具有NF-κB响应特性的sgSPARC-ap能够区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞，相较于非肿瘤细胞，在肿瘤细胞中对SPARC表达的上调作用显著更强（图2）。![]()
图2. SP-NPs以响应NF-κB活性的方式特异性上调肿瘤细胞SPARC含量
接下来研究者构建多个实验模型，包括膀胱癌细胞系、类器官和小鼠皮下移植瘤，从不同水平验证包载了SPARC基因调控元件的SP-NPs，经多次给药后，是否能够特异性上调肿瘤中SPARC的含量，并提高后续给药的SP-NPs的肿瘤递送效率（图3和图4）。结果表明，（1）初次给药的SP-NPs能够显著促进膀胱癌细胞系对第二次给药SP-NPs的摄取效率，并且细胞对SP-NPs的摄取增加依赖于上调的SPARC蛋白实现；（2）SP-NPs的多次给药能够促进自身对膀胱癌类器官的渗透，相比于对照组多分布于类器官边缘，SP-NPs能够在相同时间内到达类器官的内部深处；（3）SP-NPs的多次给药还能提高载体对小鼠皮下肿瘤的靶向富集效率，第三次注射的SP-NPs相比于对照组，在肿瘤部位富集浓度更高，且滞留时间更久。SP-NPs的SPARC上调和靶向促进作用主要局限在肿瘤组织中，在包括心、肝、脾、肺、肾等重要脏器中均未显著体现。![]()
图3. SP-NPs促进白蛋白载体的细胞摄取和组织渗透
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图4. SP-NPs增强白蛋白载体在体内的膀胱癌靶向富集
为了进一步验证上述正反馈循环策略的有效性，研究者设计了SP-NPs与商品化的白蛋白结合型紫杉醇纳米制剂ABR的组合给药策略，以确定SP-NPs是否能够提高同样作为白蛋白载体的ABR的肿瘤递送效率（图5）。细胞杀伤实验表明，SP-NPs的预处理能够显著提高ABR对膀胱癌细胞系的凋亡诱导杀伤作用，ABR的半致死浓度降低逾4倍。小鼠皮下瘤治疗实验也证实SP-NPs的预处理能够有效提高ABR对膀胱癌的生长抑制作用。经SP-NPs + ABR治疗的肿瘤，其SPARC表达量明显上调，瘤内紫杉醇含量也显著增高，肿瘤细胞的生长活性受到显著抑制。上述结果均表明SP-NPs能够有效提高同为白蛋白载体Abraxane的肿瘤靶向和抗肿瘤杀伤作用。![]()
图5. SP-NPs预处理显著提高Abraxane的抗肿瘤疗效
由于白蛋白已被广泛应用于多种药物递送研究，SP-NPs有望通过联合应用提高其它白蛋白载体用于不同治疗背景下的实体肿瘤的应用。此外，基于靶细胞特异响应性的基因调控元件的正反馈放大策略理论上也适用于其他利用配体-受体介导的靶向药物递送系统，通过设计相应的调控靶受体的基因调控元件，可以选择性地上调目的细胞或组织中靶受体表达，从而以一种主动且简便的方式显著提高载体的肿瘤递送效率，实现增强抗肿瘤疗效的目的。
- 建立了"HSA-SPARC"正反馈循环放大效应，通过多次给药逐步提高肿瘤组织中SPARC的含量，有效增强了白蛋白载体的肿瘤递送效率；
- 引入合成生物学策略研究药物递送技术，通过主动感知干预的方式调控肿瘤微环境以利于药物的富集，为增强药物载体的肿瘤靶向递送研究提供了新的研究思路和策略。
Volume 366, February 2024, Pages 596-610
https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.12.057
黄卫人，深圳大学第一附属医院研究员，博士生导师，深圳市转化医学研究院副院长，广东省特支计划杰出人才（南粤百杰），深圳市国家级高层次领军人才，国家重点研发计划首席科学家。主要从事泌尿肿瘤临床与应用基础研究。已在Nature Methods、Nature Communications、Science Bulletin、Advanced science等国际权威学术杂志发表论文100余篇，以第一人完成人获得中华医学科技奖，深圳市自然科学奖，获批国家发明专利14项。
郑彬彬，深圳大学第一附属医院深圳市转化医学研究院专职科研人员，主要研究方向：结合纳米技术与合成生物学技术开发用于蛋白质、基因或疫苗佐剂等药物的新型递送系统。
- C. Park, J. Jo, M. Song, et al, Secreted protein acidic and rich in cysteine mediates active targeting of human serum albumin in U87MG xenograft mouse models, Theranostics, 9 (2019) 7447–7457.
- G. Pascual-Pasto, H. Castillo-Ecija, N. Unceta, et al, SPARC-mediated long-term retention of nab-paclitaxel in pediatric sarcomas, J. Control. Release, 342 (2022) 81-92.
- L. Liu, F. Hu, H. Wang, et al, Secreted protein acidic and rich in cysteine mediated biomimetic delivery of methotrexate by albumin-based nanomedicines for rheumatoid arthritis therapy, Acs Nano, 13 (2019) 5036-5048.
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