近期，华中科技大学同济医学院附属协和医院史琛教授团队在《Journal of Controlled Release》期刊2024年第369期上发表了题为“Regulatory T cell-derived exosome mediated macrophages polarization for osteogenic differentiation in fracture repair”的研究论文。骨折是创伤治疗中亟待解决的问题，其不良预后常表现为延迟愈合，给患者造成严重的经济和生活负担，因此探索有效促进骨折愈合的新型治疗策略具有重要意义。巨噬细胞选择性极化以及成骨前体细胞募集在骨折愈合中起关键作用。该团队分离调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）来源的外泌体(Treg derived exosome，Treg-Exo)，探索其在骨折愈合过程中发挥的关键作用。并进一步开发了CD39/CD73抗体修饰的微流控芯片，以检测及纯化特异性抗体表达的外泌体。Treg-Exo利用表面携带的胞外酶CD39和CD73催化骨折区域高水平的ATP水解为腺苷，激活AC/cAMP/PKA/CREB信号通路诱导巨噬细胞向M2型极化，从而促进间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）增殖及成骨分化。为进一步提高外泌体的递送效能，并整合骨折愈合中的多种生物学进程，该团队制备了可注射型水凝胶共递送Treg-Exo和基质细胞衍生因子1α（Stromal cell-derived factor 1α，SDF-1α），同时促进骨折部位MSC的募集及成骨分化，双管齐下，达到更好的骨损伤治疗效果。该研究为骨损伤修复提供了一种新型治疗策略。
调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）在维持免疫稳态、预防自身免疫性疾病和调节炎症过程中至关重要。近年来研究发现，Treg有促进组织修复的作用，如促进肺损伤[1]、心肌梗死造成的损伤[2]等组织的修复。然而，Treg在骨折修复中的作用仍需进一步研究。外泌体（Exosome，Exo）是由活细胞分泌的直径30 nm-150 nm的球形或杯状囊泡，具有典型的脂质双层结构，携带多种生物活性分子，如蛋白质、microRNA、细胞因子等，表现出与亲本细胞相似的生物学功能。Exo可通过细胞间运输将生物信息长距离传递到受体细胞，有效地介导细胞间的生物通讯。同时，Exo避免了繁琐昂贵的功能化修饰，可直接利用所携带的生物分子进行疾病的生物治疗。近年来，越来越多的研究表明，Treg-Exo是Treg与其他细胞相互作用的主要方式之一。该团队重点关注Treg-Exo在骨损伤修复中发挥的作用。骨折愈合过程包括炎症反应、软骨骨痂形成、骨性骨痂形成及骨痂塑形四个阶段，巨噬细胞参与调控整个过程，是骨愈合生物反应中不可或缺的部分。骨折后，大量巨噬细胞迅速迁徙至骨折部位，并在炎症刺激下分化为M1和M2型巨噬细胞[3]。M1亚群以分泌高水平的促炎因子，如白细胞介素-1（IL-1）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）为特点，可在初始急性炎症阶段进行吞噬以清除坏死细胞和纤维蛋白血栓，但会加剧炎症反应和组织坏死。M2亚群，以高表达精氨酸酶-1（Arg-1）、CD206等蛋白分子为特点，具有较强骨修复能力。除有显著的抗炎作用之外，M2还可促进细胞迁移增殖、胶原合成和血管生成等。因此，基于抑制M1、促进M2型巨噬细胞极化的治疗策略，对有效促进骨折愈合具有重要价值。该研究重点关注Treg-Exo通过调控巨噬细胞极化对骨折修复进程的影响。
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可注射型海藻酸钠水凝胶介导MSC募集和巨噬细胞极化促进骨折愈合的示意图
利用磁珠分选分离提取鼠源性Treg原代细胞，培养扩增后，利用差速离心法从细胞上清中获得了Treg-Exo，对其形貌、粒度分布、电位、稳定性及表面特异性蛋白标志物进行表征，确定其能用于后续实验（图1）。
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图1. 成功分离Treg细胞及Treg-Exo
通过单细胞测序发现脾脏和骨痂Treg细胞中均表达CD39和CD73，且两者在骨痂Treg中的表达均显著高于脾脏Treg，表明CD39/CD73在Treg影响骨折愈合中可能发挥重要作用（图2）。
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图2. 骨痂Treg高表达CD39/CD73
传统的外泌体分离方法为过滤、超速离心等，受到回收率低、纯度不足和蛋白质污染等限制，并且难以获取表达特定分子的特异性外泌体。近年来，微流控芯片利用流体控制精确、样本量要求小、操作简单、自动化程度高、通量高等优势，被开发用于外泌体的提取，与常规方法相比，大大提高了外泌体的纯度和产量[4]。本研究制备了抗体修饰的PDMS微流控芯片用于捕获CD39+/CD73+ Treg-Exo（图3）。聚多巴胺（Polydopamine，PDA）是研究者受贻贝中一种粘附蛋白的启发得来，这种粘附蛋白可在海水或盐水条件下粘附到各种材料表面。多巴胺自我聚合形成的PDA可以自发地涂覆在各种材料上，在碱性pH条件下形成的PDA膜对胺和巯基具有潜在反应性，提高了其生物共轭能力。邻苯二酚和伯胺基团也赋予了PDA优良的生物相容性和抗氧化能力。将PDA涂层进一步用链霉亲和素与磺酸基-NHS-SS-生物素修饰以固定CD39抗体及CD73抗体。利用亲脂性荧光染料香豆素6对被捕获的外泌体进行染色，进一步用二硫苏糖醇洗脱被捕获的外泌体，流式检测可发现，Treg来源的外泌体携带一定数量的CD39和CD73，抗体修饰的微流控芯片可显著提高这一比例（图4）。
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图3. 抗体修饰的微流控芯片
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图4. 微流控芯片可提高Treg-Exo中CD39/CD73比例
利用ATP与AMP水解反应进一步证实了Treg-Exo具有良好的CD39/CD73酶活性，可催化ATP水解生成腺苷，诱导巨噬细胞向M2型极化。进一步探索Treg-Exo调控巨噬细胞极化的机制[5]，发现其可通过携带的CD39/CD73激活腺苷下游AC/cAMP/PKA/CREB通路，进而调控巨噬细胞极化相关靶基因的转录（图5）。
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图5. Treg-Exo具有良好的CD39/CD73酶活性，通过水解ATP生成腺苷激活AC/cAMP/PKA/CREB通路，进而调控巨噬细胞向M2型极化
M2型巨噬细胞在组织修复中具有重要作用，该研究通过EdU增殖实验以及成骨分化实验证实了Treg-Exo处理过的巨噬细胞培养上清可促进成骨前体细胞BMSC增殖及成骨分化（图6）。
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图6. Treg-Exo通过诱导巨噬细胞M2型极化促进BMSC增殖及成骨分化
体内实验结果显示Treg-Exo处理组小鼠骨痂生长速度快于对照组，骨相关参数骨体积（Bone volume，BV）、总组织体积（Tissue volume，TV）以及体积比（BV/TV）进一步证实了Treg-Exo在体内促进骨折愈合（图7）。
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图7. Treg-Exo在体内促进骨折愈合
并且骨痂中PKA以及CREB磷酸化水平上调，M2型巨噬细胞比例增加，表明Treg-Exo在体内同样激活腺苷下游通路，通过促进巨噬细胞向M2型极化来发挥骨折修复作用（图8）。
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图8. Treg-Exo在体内激活腺苷下游通路促进巨噬细胞向M2型极化
进一步构建海藻酸钠水凝胶共递送Treg-Exo与SDF-1α。该水凝胶在室温下迅速呈非流动态，可注射使用；扫描电镜下呈均匀疏松的多孔结构，利于药物的包载及释放；流变学特性适合注射及组织修复使用；具备缓释效能（图9）。
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图9. 水凝胶表征
体内实验显示Treg-Exo/SDF-1α-gel组小鼠骨痂生长速度最快，二者联用可增强骨折治疗效果。目前普遍认为MSC缺乏造血标志物CD45，而高表达CD29。在骨折后第3天，SDF-1α-gel和Treg-Exo/SDF-1α-gel处理组中CD29+细胞普遍聚集，在给药后第7天减少，表明SDF-1α成功将MSC募集到骨折部位（图10）。
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图10. MSC被成骨募集至骨折部位
体内实验显示Treg-Exo/SDF-1α-gel组小鼠骨痂生长速度最快，二者联用可增强骨折治疗效果。目前普遍认为MSC缺乏造血标志物CD45，而高表达CD29。在骨折后第3天，SDF-1α-gel和Treg-Exo/SDF-1α-gel处理组中CD29+细胞普遍聚集，在给药后第7天减少，表明SDF-1α成功将MSC募集到骨折部位（图10）。
- 证实了Treg-Exo通过携带CD39/CD73催化骨折部位高水平的ATP水解生成腺苷，进而激活AC/cAMP/PKA/CREB通路，促进巨噬细胞向M2型极化，从而影响骨折愈合进程；
- 利用微流控芯片检测并富集特异性表达CD39/CD73的Treg-Exo；
- 制备了共递送Treg-Exo和SDF-1α的可注射型水凝胶，发挥Treg-Exo促进巨噬细胞极化和SDF-1α促进MSC募集的协同作用，显著促进骨折愈合。
Volume 369, May 2024, Pages 266-282https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2024.03.028
史琛，华中科技大学同济医学院附属协和医院药学部副主任，医学博士、主任药师、博士生导师。主要研究方向为临床药学、药物递送临床转化及抗肿瘤药理。主持国家自然科学基金及湖北省自然科学基金6项、国家科技部重点研发计划子课题1项、参与其他国家、省及市级课题15余项；获得湖北省科技进步二等奖一项；在STTT、EClinicalMedicine、ACS Nano、Small、APSB、JCR、CEJ、Pharmacol Ther、Journal of Nanobiotechnology 、Carbohydrate Polymers等国际权威期刊发表论文50余篇，中文30余篇；参编参译书籍5部、获批实用新型专利1项、受理发明专利2项、参与制定行业标准2部、参与编撰制定国际及全国专家共识6项。吴婷婷，华中科技大学同济医学院附属协和医院药学部主管药师，医学博士。主要从事仿生药物递送系统的构建及临床转化研究，主持国家自然科学基金青年基金，获武汉黄鹤英才优秀青年人才称号，以第一/通讯作者发表学术论文15篇，参编专著2部，获批发明专利1项，受理发明专利2项。
王璐璐，华中科技大学同济医学院附属协和医院药学部硕士研究生。主要研究方向为骨损伤修复与药物递送系统。
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