近期，中国科学院过程工程研究所张松平研究员团队在《Journal of Controlled Release》 期刊2024年第368期上发表了题为“In situ bio-mineralized Mn nanoadjuvant enhances anti-influenza immunity of recombinant virus-like particle vaccines”的研究论文。该团队模仿天然流感病毒抗原和免疫刺激剂的空间分布，在重组乙肝核心抗原病毒样颗粒（HBc VLP）骨架上嵌合流感的M2e抗原，VLP内部原位矿化合成STING激动剂Mn3O4，在VLP颗粒表面组装HA抗原，制备出仿生双抗原重组病毒样颗粒流感疫苗。研究发现内部矿化Mn纳米佐剂，可以有效提高VLP流感疫苗的先天抗病毒、体液和细胞免疫，并提高抗原/佐剂生物利用度和Mn佐剂的生物安全性。本研究为解决VLP疫苗在激活针对病毒感染的先天免疫方面效率较低的问题提供一种新的思路。病毒样颗粒（Virus-like particles，VLP）具有与天然病毒相似的结构及良好的安全性，是重要的疫苗制备平台。由于缺乏病毒核酸，VLP在诱导天然免疫方面的能力有限，因此，添加免疫刺激剂对于增强VLP疫苗的免疫有效性通常是必要的。一些金属离子，如Mn2+，已被证实可以激活STING信号通路，诱导产生I型干扰素，增强针对病毒和细胞内细菌感染的先天免疫防御[1]。然而游离的Mn2+会被快速代谢，利用率低，且存在潜在的神经毒性，因此通常制备成胶体锰、蛋白-锰杂化颗粒等剂型，与抗原共混或者将抗原吸附在表面使用。VLP的天然纳米笼状结构，为原位矿化合成Mn佐剂提供可能，不仅可以实现抗原与Mn佐剂的共递送，而且将Mn佐剂装载在VLP内部，在空间上模仿免疫增强剂在天然病毒内的分布，有望更好得实现免疫增效。基于以上背景，该团队前期在大肠杆菌系统表达制备了N-端融合Spy-Tag、MIR区嵌合流感M2e抗原的重组乙肝核心抗原病毒样颗粒（Tag-HBc-M2e，简称THM VLP）[2]。为了增强基于HBc VLP纳米疫苗的抗流感免疫，该项研究中，团队利用前期发现的HBc VLP具有的热敏性载药通道[3]，在50oC加热条件下使Mn2+高效扩散进入THM颗粒内部，在NaOH作用下发生矿化反应，实现在VLP纳米笼内原位合成MnOx纳米佐剂；进一步在THM@Mn颗粒表面通过SpyTag/SpyCatcher偶联重组流感HA抗原，成功制备出双抗原流感疫苗THM-HA@Mn。在该疫苗中，MnOx分布于VLP内部，M2e嵌合于骨架上，HA分布于表面，因此在空间上模仿了免疫元件（HA和M2e抗原）以及抗原和免疫增效元件（佐剂）在天然病毒中的分布。疫苗接种后，装载有抗原和MnOx的纳米颗粒被APC摄取，通过内体溶酶体途径被提呈给MHCI和MHCII，并与下游的CD4和CD8细胞相互作用激活适应性免疫。在酸性溶酶体中，MnOx免疫刺激物分解为Mn2+，并导致溶酶体不完整，实现抗原和免疫刺激物的胞质释放，激活STING通路，产生I型干扰素，促进细胞免疫。图1所示为HM-HA@Mn纳米疫苗的制备及其引发体液和细胞免疫的潜在机制示意图。
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图1. SpyTag-HBc-M2e-HA@Mn（简称THM-HA@Mn）杂合纳米疫苗的制备（A）及其引发体液和细胞免疫的潜在机制的示意图（B）
高分辨TEM、XRD、XPS等表征证实了THM VLP腔室内MnOx的成功合成，并确定其主要成分为Mn3O4；DLS检测显示Mn3O4的装载未对VLP的粒径和电位产生明显影响（图2A-2C）。与无VLP条件下合成的锰颗粒佐剂syn-MnOx相比，THM-HA@Mn具有优异的颗粒分散稳定性（图2D）。体外DC细胞摄取实验研究发现，与THM-HA以及THM-HA+Mn的混合组相比，内部装载Mn佐剂的THM-HA@Mn可以更高效地被DC摄取（图2E）。通过cGAS-STING通路抑制实验验证了THM-HA@Mn与THM-HA+Mn均能通过STING通路有效激活APC，产生IFN-β，但前者具有更高的STING蛋白表达（图2F）。![]()
图2. THM-HA@Mn的制备和表征
（A）TEM图谱；（B）XRD图谱；（C）DLS分析；（D）颗粒稳定性分散检测；（E）DC2.4细胞对抗原的摄取效率；（F）STING蛋白的表达（WB）以及cGAS-STING通路抑制前后IFN-β水平。
小鼠体内免疫研究发现，在免疫初期，注射96 h后，THM-HA@Mn组和THM-HA+Mn组的注射部位仍可检测到较强的抗原荧光信号；腘窝淋巴结中的荧光信号在注射6 h后达到峰值，抗原在淋巴结中保持72 h之久(图3A)。皮下注射7天后，THM-HA@Mn促进了淋巴结中DC成熟和脾脏中GC形成，在起始阶段有效激活免疫(图3B-3C)。抗原特异性抗体结果显示，在二免14天后，THM-HA@Mn免疫诱导的rHA特异性抗体比THM-HA组高7.0-8.0倍（P<0.01）；是含有双倍剂量THM-HA10 μg的1.5倍，表明VLPs内Mn佐剂的内部矿化可以在相对较低的抗原剂量下显著增强抗原特异性抗体反应（图3D），并有效激活细胞免疫（图3E）。针对M2e抗原的特异性抗体也具有类似规律。![]()
图3. THM-HA@Mn体内免疫评价
（A）淋巴结抗原荧光变化；（B）淋巴结中DC成熟；（C）脾脏中生发中心（GC）的形成；（D）rHA特异性IgG；（E）CD8+T细胞中的TEM占比。
细胞毒性结果显示THM-HA@Mn具有低的细胞毒性（图4A）；小鼠免疫后72 h内血清中Mn的药代动力学曲线显示，THM-HA@Mn组的相对曲线下面积（AUC）是THM-HA+Mn组的3.66倍（399.9 vs. 109.3 µg·h/L），表明THM-HA@Mn的相对生物利用度优于THM-HA+Mn（图4B）。72h后分析各主要器官中Mn2+浓度，显示Mn主要为肝脏代谢。与THM-HA+Mn相比，THM-HA@Mn组在小鼠大脑中表现出更低的Mn2+水平（P<0.05），表明将Mn纳米佐剂装载于VLP内部，可以有效降低Mn2+相关神经毒性的潜在风险（图4C-4D）。H&E染色结果显示，各组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑等主要器官均保持正常的组织形态（图4E）。以上结果表明，内部装载Mn佐剂的THM-HA@Mn比THM-HA+Mn具有更好的生物安全性。因此可以作为一种安全的具有前景的平台技术，用于高效VLP疫苗的制备。![]()
图4. THM-HA@Mn生物安全性
（A）细胞毒性；（B）药代动力学曲线；（C-D）组织中的Mn含量；（E）H&E染色。
综上，本研究在重组HBc VLP内部成功原位矿化Mn纳米佐剂，通过促进STING通路激活DC，显著提高了VLP疫苗的抗流感免疫，为基于VLP的疫苗设计提供了新策略。
在重组HBc VLP颗粒腔室内部原位生物矿化合成Mn纳米佐剂，其主要成分为Mn3O4；
THM-HA@Mn纳米疫苗通过促进STING通路激活DC，提高了VLP疫苗的抗流感免疫；
THM-HA@Mn纳米疫苗具有更好的分散稳定性、更高的抗原/佐剂生物利用度、以及生物安全性。
Volume 368, April 2024, Pages 275-289
https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2024.02.027
张松平，中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室研究员，生物医药研究部主任。近期主要研究方向是疫苗抗原、蛋白质药物、核酸等生物大分子药物的分离纯化和稳定制剂研究。针对生物大分子在纯化制备和应用中易失活的难题，发展了一系列质控新技术，建立了抗失活纯化技术和新型递送系统。在J Controlled Release，Biomaterials, J Virology、等期刊发表论文150余篇，申请发明专利40余项，多项技术成果在疫苗和蛋白质药物研发和生产中获得实施应用。国家农业部兽药评审专家，J Chromatography A和Biochem Engin J期刊编委。
盛亚男，中国科学院大学博士研究生，研究方向：生物分离与制剂研究。李正军，中国科学院过程工程研究所，副研究员，从事蛋白质和mRNA制备及递送系统研究。
Wang C.G. et al. Manganese increases the sensitivity of the cGAS-STING pathway for double-stranded DNA and is required for the host defense against DNA viruses. Immunity, 48 (2018) 675-687. e7.
Sheng YN, et al. The position of Spy Tag/Catcher system in Hepatitis B Core protein particle affects the immunogenicity and stability of the synthetic vaccine. Vaccine, 41 (2023) 4867-4878.
Li Z.J., et al. Thermal-triggered loading and GSH-responsive releasing property of HBc particles for drug delivery. J. Control. Release, 362 (2023) 784-796.
Lu F.Y., et al. Thermal-triggered packing of lipophilic NIR dye IR780 in hepatitis B core at critical ionic strength and cargo-host ratio for improved stability and enhanced cancer phototherapy. Biomaterials, 276 （2021）121035.
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