免疫治疗在对抗肿瘤转移和复发方面发挥着举足轻重的作用。近年来，多种免疫治疗策略被相继开发应用，正逐渐推动着癌症治疗范式的转变。但由于以细胞凋亡为特征的程序性细胞死亡（PCD）往往分解成凋亡囊泡，无法逆转肿瘤细胞顽固性的免疫抑制TME。因此，如何绕过细胞凋亡、寻找激活细胞独特死亡形式以打破“免疫沉默”的TME，实现材料自身增敏免疫治疗是一大挑战。
焦亡是一种以膜孔形成、细胞肿胀鼓泡、内容物和炎症因子释放为特征，由炎性小体驱动的新型独特PCD。由于其能够释放出高水平的损伤相关分子模式（DAMPs）和促炎因子，引发强烈的炎症反应，而逐渐被认为是激活肿瘤免疫治疗的一大新风向标[3]。目前，已陆续报道出一些焦亡诱导剂用于肿瘤免疫治疗[4]。然而，这些诱导剂常以不可控的方式引发焦亡，导致体内不良反应，存在潜在的生物安全问题，这对其在生物医学中的应用推广构成了一大瓶颈。由于超声具有精确可控、高组织穿透和时空选择性，已被认为是最有前途和通用的物理刺激之一。这种特性使得在密集细胞外基质环境中进行深度穿透到肿瘤组织的声动力治疗（SDT）成为可能[5]。然而，作为肿瘤治疗的有力物理手段，超声虽然有着无可媲美的优势，但是肿瘤内的乏氧环境和高表达的还原性谷胱甘肽（GSH）会大幅降低声敏剂产生单线态氧（1O2）的能力和功效，从而影响SDT的治疗效果。而且，目前关于声动力触发的增强型焦亡以诱导免疫治疗策略还鲜有报道且具有一定的挑战性[6]。
在此，该团队设计合成了一种具有四重类酶活性的新型可生物降解CuTA纳米针，发现其能够在减小全身副作用下有效诱导焦亡。同时与声敏剂Ce6结合后（CuTA-Ce6），超声刺激下触发的SDT能够进一步放大焦亡效果，实现增敏性免疫治疗。具体而言，具有类超氧化物歧化酶（SOD）、类过氧化氢酶（CAT）、类谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和类过氧化物酶（POD）活性的CuTA纳米针能够在GSH和H2O2过表达的TME中被激活至“开启”状态，从而有效缓解肿瘤的乏氧环境，并显著升高活性氧（ROS）水平。CuTA在被降解的同时可破坏肿瘤细胞活化的抗氧化系统，并引发炎症反应激活炎症小体，促进半胱天冬蛋白酶-3（Caspase-3）裂解含有Gasdermin结构域的蛋白家族成员Gasdermin-E（GSDME），同时释放的DAMPs可进一步打破“免疫沉默”的TME，进而在减小全身副作用的同时实现焦亡介导的免疫治疗。CuTA纳米针与声敏剂Ce6进行键连后，可将CuTA产生的O2进一步转化为对肿瘤细胞具有杀伤效果的1O2。结果发现，结合CuTA-Ce6纳米催化剂驱动的级联反应和SDT途径的“双管齐下”策略能够产生包括羟基自由基（·OH）和1O2在内的更强ROS风暴，进一步放大了焦亡诱发的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）极化、树突细胞（DCs）成熟和T细胞启动的强烈免疫反应，即实现了增强型免疫治疗（图1）。
图1. CuTA纳米针和CuTA-Ce6焦亡放大器的合成和治疗示意图
图2. CuTA和CuTA-Ce6的合成与表征
图3a为CuTA纳米针的4种模拟酶活性和CuTA-Ce6的ROS放大行为示意图。通过相关指示剂、溶氧仪和电子自旋共振法（ESR）证明了CuTA具有SOD、CAT、GSH-Px和POD样活性。其中，CAT和POD样活性的Vmax分别为12.8 mg L-1 min-1和21.1×10-8 M s-1（图3b-3i）。
图3. CuTA的多重类酶活性评价
分别通过检测探针ABDA（图4a-4c）、SOSG指示剂（图4d-4f）和ESR（图4g）对US刺激下CuTA-Ce6产生的1O2进行检测，发现CuTA-Ce6+US具备优异的1O2产生能力。更重要的是，相较于CuTA-Ce6，CuTA-Ce6+H2O2实验组在超声刺激下的1O2产生效果更为明显，说明CuTA-Ce6发挥CAT样活性催化H2O2生成了O2，继而大幅提高了1O2的产生。在体外模拟TME中，发现CuTA的针状形貌随着时间的延长而逐渐消失（即呈现出时间依赖性的降解行为），直至形成细小的纳米点（图4h）。这表明CuTA纳米针在TME中具有可降解性，有利于机体代谢清除，满足生物安全性的需求。
图4. CuTA-Ce6的体外氧化应激扩增和生物降解行为研究
继续研究了CuTA纳米针在4T1细胞中的4种类酶活性。二氢乙锭（DHE）作为超氧化物阴离子荧光探针，能够在超氧阴离子自由基（O2·-）存在时脱氢形成溴化乙锭而发出红色荧光（图5a）。从图5b中可以看出，随着孵育时间的增加，细胞中红色荧光在减弱，说明胞内的O2·-在减少，证实了CuTA纳米针具有SOD样酶活性，可消耗O2·-。利用GSH检测试剂盒对CuTA消耗GSH性能进行了评估。发现与对照组相比，CuTA能够高效地消耗4T1细胞中的还原性GSH（图5c）。接下来，通过细胞毒性实验MTT法和细胞活死染色实验证明了CuTA和CuTA-Ce6可对肿瘤细胞造成相当程度的杀伤。此外，在超声刺激下，CuTA-Ce6对肿瘤细胞的杀伤效果进一步增强（图5d-5g）。
图5. US刺激下，CuTA-Ce6的类酶活性和体外肿瘤治疗效果
图6. CuTA和CuTA-Ce6+US在体外诱导细胞焦亡
鉴于CuTA-Ce6在细胞层面具有优异的抗肿瘤和免疫激活效果，进一步在Balb/C荷瘤小鼠体内进行了研究。通过对给药治疗后的小鼠免疫细胞和细胞因子进行检测，发现CuTA纳米针能够通过诱发焦亡来触发肿瘤的免疫原性细胞死亡（ICD），从而实现肿瘤的免疫治疗。与CuTA组相比，在超声刺激下的CuTA并未表现出对肿瘤治疗的任何促进作用，而CuTA-Ce6+US则能够进一步放大焦亡诱导的免疫反应，实现更加强大的免疫治疗（图7）。
图7. 不同治疗方案在荷瘤小鼠体内诱导的免疫激活反应
建立了4T1荷瘤小鼠模型来验证不同方案处理下的肿瘤治疗效果（图8a）。发现超声刺激下的CuTA-Ce6对肿瘤的抑制效果最强，治疗效果最好（图8b-8f）。为了进一步评价治疗组小鼠的免疫激活程度，对肿瘤切片进行了CRT、CD4+/CD8+免疫荧光染色测试。与预期的结果一致，治疗组小鼠的肿瘤切片均暴露出CRT、CD4+和CD8+的绿色荧光信号，且CuTA-Ce6+US组信号最为强烈（图8g）。之后，在小鼠的寿命观察实验中发现， CuTA-Ce6+US组的小鼠在50天时的存活率达到了80%（图8h）。同时该组小鼠的血液学及血清生化指标均在正常范围内（图8i）。
图8. 不同治疗方案的体内抗肿瘤效果评估
研究亮点
合成了一种可生物降解新型焦亡放大器CuTA-Ce6，发现材料具有四种类酶活性（SOD、CAT、POD和GSH-Px）； 内源性肿瘤微环境和外源性超声刺激特异性激活CuTA-Ce6，通过酶催化级联和SDT途径放大了纳米材料引起的细胞焦亡，并进一步增强了免疫治疗效果。
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通讯作者
李春霞，山东大学化学与化工学院教授。主要从事稀土等光功能纳米材料的研究工作，以材料的控制合成—生物应用为主线，利用多学科交叉优势，致力于解决药物精准控释及肿瘤转移抑制等科学难题。近年来设计、合成了多种刺激-响应型的多功能纳米复合材料，利用肿瘤微环境的特点和近红外光的独特优势，实现了纳米材料在肿瘤部位的靶向蓄积、选择性控制释放和肿瘤协同治疗。以通讯或第一作者在Chem. Soc. Rev., Adv. Mater., Angew. Chem. Int. Ed.等国内外权威期刊上发表论文200余篇，共被他引26,000余次（H-index 92）。主持国家自然科学基金原创探索计划和延续资助项目、优秀青年基金等项目；五次入选材料领域“全球高被引科学家”；2015-2023连续入选爱思唯尔中国高被引学者榜单。
第一作者
参考资料
P. Sharma, J.P. Allison, The future of immune checkpoint therapy, Science 348(6230) (2015) 56-61. L. Chen, L. Zhou, C. Wang, Y. Han, Y. Lu, J. Liu, X. Hu, T. Yao, Y. Lin, S. Liang, S. Shi, C. Dong, Tumor-targeted drug and CpG delivery system for phototherapy and docetaxel-enhanced immunotherapy with polarization toward M1-type macrophages on triple negative breast cancers, Adv. Mater. 31(52) (2019) 1904997. X. Xu, H. Fan, Y. Yang, S. Yao, W. Yu, Z. Guo, W. Tan, Virus-like particle-induced cGAS-STING activation and AIM2 inflammasome-mediated pyroptosis for robust cancer immunotherapy, Angew. Chem. Int. Ed. 62(24) (2023) e202303010. Z. Feng, G. Chen, M. Zhong, L. Lin, Z. Mai, Y. Tang, G. Chen, W. Ma, G. Li, Y. Yang, Z. Yu, M. Yu, An acid-responsive MOF nanomedicine for augmented anti-tumor immunotherapy via a metal ion interference-mediated pyroptotic pathway, Biomaterials 302 (2023) 122333. Z. Wang, M. Wang, Y. Qian, Y. Xie, Q. Sun, M. Gao, C. Li, Dual-targeted nanoformulation with Janus structure for synergistic enhancement of sonodynamic therapy and chemotherapy, Chin. Chem. Lett. 34(7) (2023) 107853. Z. Chen, W. Liu, Z. Yang, Y. Luo, C. Qiao, A. Xie, Q. Jia, P. Yang, Z. Wang, R. Zhang, Sonodynamic-immunomodulatory nanostimulators activate pyroptosis and remodel tumor microenvironment for enhanced tumor immunotherapy, Theranostics 13(5) (2023) 1571-1583.
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