图文摘要
图1. CD146+CD271+UCMSC的获取和鉴定
图2. CD146+CD271+UCMSC sEVs的表征、摄取和体内示踪
图3. CD146+CD271+UCMSC-sEVs促进SCI小鼠后功能恢复
图4. CD146+CD271+UCMSC-sEVs在体内增强血管生成，在体外促进内皮细胞的迁移和管形成
为了探究CD146+CD271+UCMSC-sEVs促血管生成作用的潜在作用分子，我们采用microRNA测序技术，比对UCMSC-sEVs和CD146+CD271+UCMSC-sEVsmicroRNA表达的差异。其中，miR-147b-3p、miR-501-5p、miR-27a-3p和miR-19a-3p在CD146+CD271+UCMSC-sEVs中显著的高表达。既往研究报道了miR-19a-3p和miR-27a-3p与血管生成之间的相关性。为了阐明CD146+CD271+UCMSC-sEVs促进血管生成的关键分子，我们在体外分别用miR-27a-3p模拟物和miR-19a-3p模仿物处理bEnd.3细胞，以研究它们对内皮细胞行为的影响。研究结果表明，miR-27a-3p模拟物有效地增强了bEnd.3细胞的迁移和成管形成，而miR-19a-3p模仿物的作用并不显著。因此，我们选择miR-27a-3p作为靶分子。进一步实验发现，抑制miR-27a-3p显著减弱CD146+CD271+UCMSC-sEVs的促血管生成作用。值得注意的是，miR-27a-3p模拟物没有完全复制CD146+CD271+UCMSC-sEVs的功能。因此，我们推测sEVs包含大量共同参与调节血管生成的生物活性物质，虽然miR-27a-3p是一个关键分子，但它可能不是控制血管生成的唯一决定因素。
为了进一步确定CD146+CD271+UCMSC-sEVs是否可以将miR-27a-3p转移到SCI小鼠脊髓微血管，采用FISH实验检测鼻内递送CD146+CD271+UCMSC-sEVs的SCI小鼠脊髓标本，结果证实，SCI 7天后，鼻内递送CD146+CD271+UCMSC-sEVs的小鼠脊髓微血管中检测到miR-27a-3p表达的显著增加。然而，在SCI后14天和56天，miR-27a-3p的表达几乎无法检测到。这提示CD146+CD271+UCMSC-sEVs具有将miR-27a-3p转移到微血管的能力，但不增加miR-27a-3p的内源性表达。
图5. miR-27a-3p在CD146+CD271+UCMSC-sEVs中大量表达，并可在SCI后转移到脊髓微血管
为了进一步阐明miR-27a-3p在介导CD146+CD271+UCMSC-sEVs促进SCI后功能恢复方面的作用，我们构建了敲降miR-27a-3p的CD146+CD271+UCMSC，并提取其sEVs（miR-27a-3pIN-sEVs）。与CD146+CD271+UCMSC-sEVs（NC-sEVs）相比，miR-27a-3pIN-sEVs改善SCI小鼠的BMS评分及神经电生理的作用减弱。此外，H&E染色表明，miR-27a-3p的敲降减弱了NC-sEVs减少损伤面积及改善膀胱病理性重塑的作用。这些结果提示了CD146+CD271+UCMSC-sEVs促进SCI后功能恢复是miR-27a-3p介导的。我们进一步探讨了来源于CD146+CD271+UCMSC-sEVs的miR-27a-3p是否调控了血管生成这一过程。与NC-sEVs组相比，miR-27a-3pIN-sEVs组CD31+染色面积减少。此外，CD31+Ki67+细胞的数量也因miR-27a-3p的敲降而减少。总之，这些结果表明miR-27a-3p可能是CD146+CD271+UCMSC-sEVs促进SCI后血管生成的关键分子。
图6. miR-27a-3p介导了CD146+CD271+UCMSC-sEVs改善SCI后功能恢复和血管生成的作用
进一步探究来源于CD146+CD271+UCMSC-sEVs的miR-27a-3p发挥作用的潜在机制。利用miRNA靶标的在线数据库miRDB和TargetScan来鉴定miR-27a-3p的靶基因。生物信息学分析发现DLL4可能是与血管生成相关的潜在靶点。对bEnd.3细胞给予CD146+CD271+UCMSC-sEVs后，DLL4的mRNA表达显著降低。双荧光素酶实验证实DLL4是miR-27a-3p的直接靶标。随后，对SCI小鼠给予NC-sEVs和miR-27a-3pIN-sEVs，以探究miR-27a-3p调节DLL4表达中的作用。与PBS组相比，NC-sEVs组小鼠的脊髓血管内皮细胞DLL4表达水平较低。免疫荧光染色实验证实，在miR-27a-3p敲降后，这些作用被逆转。Western blot的结果也与荧光实验的结果相一致。
图7. CD146+CD271+UCMSC-sEVs衍生的miR-27a-3p可下调血管内皮细胞中DLL4的表达
为了阐明DLL4在介导CD146+CD271+UCMSC-sEVs的促血管生成中的作用，我们在体外使用DLL4质粒以在bEnd.3细胞中过表达DLL4，并在体内使用AAV-DLL4敲低脊髓中的DLL4表达。DLL4过表达减弱了CD146+CD271+UCMSC-sEVs对bEnd.3细胞的迁移和成管形成的促进作用。同时，体内实验也发现敲降DLL4有效地改善了因miR-27a-3p的敲降而引起的脊髓CD31+面积和Ki67+CD31+细胞计数的降低。这些研究结果表明，CD146+CD271+UCMSC-sEVs可能通过miR-27a-3p/DLL4轴促进血管生成。
图8. CD146+CD271+UCMSC-sEVs通过miR-27a-3p/DLL4轴促进血管生成
研究亮点
鼻内递送CD146+CD271+UCMSC-sEVs可有效促进SCI后血管生成和功能恢复； miR-27a-3p介导了CD146+CD271+UCMSC-sEVs改善SCI后功能恢复和血管生成的作用； CD146+CD271+UCMSC-sEVs可能是通过miR-27a-3p/DLL4轴促进SCI后血管生成。
文章信息
作者信息
通讯作者
第一作者
孙一，中南大学湘雅医院2021级博士研究生。主要从事干细胞亚群外泌体用于脊髓损伤治疗的研究。
赵晋云，中南大学湘雅医院2021级博士研究生。主要从事脊髓损伤的表观遗传学调节相关研究。
参考资料
Sun Y., et al., Intranasal delivery of small extracellular vesicles from specific subpopulation of mesenchymal stem cells mitigates traumatic spinal cord injury. J Control Release, 2024.369:335-350.
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