Cover Story：口颊黏附膜递送疫苗对抗呼吸道感染
文摘
科学
2024-09-18 20:01
四川
近期，斯洛文尼亚国家化学研究所Roman Jerala团队在《Journal of Controlled Release》期刊2024年第371期上发表了题为“Mucoadhesive film for oral delivery of vaccines for protection of the respiratory tract”的封面论文。该团队开发了一种新型口颊黏附膜 （MAF），旨在增强疫苗对口颊黏膜的渗透，提高黏膜疫苗的效用。MAF可用于多种类型疫苗的黏膜递送，包括DNA质粒、病毒载体和包载mRNA的脂质纳米颗粒（mRNA/LNP）等。MAF由具有缓释作用的水溶性聚合物和不透水的背衬层组成，可确保黏附在黏膜表面的疫苗成分的受控单向释放并保护其不受口腔液的影响，这增强了疫苗活性成分对口颊黏膜的渗透。该制剂在BALB/c小鼠上引发了与肌肉注射相当的抗体水平与细胞免疫反应，并显著诱导了黏膜分泌型IgA的产生，展示了其作为疫苗增强剂的潜力，在预防呼吸道感染方面表现出优势。此外，作为一种具有非侵入性与简便性的递送平台，MAF有望降低患者接种疫苗的心理障碍，提高疫苗的接受度和可及性。
疫苗递送途径显著影响了免疫反应的强度。传统的肌肉注射或皮下注射疫苗可引起全身免疫反应，然而这些方法无法有效诱导黏膜免疫、防止病原体通过黏膜表面（如呼吸道表面）侵入人体。与常见的肌肉注射相比，黏膜疫苗接种可以通过黏膜相关淋巴组织引发先天性和适应性免疫反应，诱导黏膜分泌型IgA的产生1。IgA可以在黏膜局部中和呼吸道病毒或阻止它们与上皮细胞的附着，阻断病毒进一步传播，为机体提供了更好的保护作用1–3。然而经口疫苗递送至呼吸道近端淋巴结的效率低，对呼吸道病原体的保护作用较差。因此，该团队开发了一种新型口颊黏附膜（MAF），旨在增强疫苗对口颊黏膜的渗透，提高黏膜疫苗效用。研究团队将乙基纤维素与邻苯二甲酸二丁酯溶解于丙酮和2-丙醇（2：1）混合溶液，并在室温下200 rpm搅拌2 h，而后将溶液室温干燥过夜，制备得到背衬层。MAF黏附层由支链淀粉、海藻糖二水合物、蔗糖、甘油和疫苗活性成分溶解在PBS中制备。黏附层溶液也可掺入增塑剂和渗透增强剂等，以增强活性成分的渗透。将MAF黏附层溶液所需要的所有组分预混，并以大约100 rpm的转速搅拌2小时直至完全均匀。而后将溶液在冰箱中静置1 h，以确保溶液中没有气泡。将含有粘膜粘附聚合物的溶液浇铸在干燥的背衬层上，并在室温下干燥过夜。最后将片材根据实验要求切割成合适的大小，即可得到用于实验的MAF制剂。SEM图像显示MAF具有均匀且密集的双层结构，双层接触面光滑且可区分（图1E）。所得薄膜表面光滑，没有缺陷或层分离的迹象。MAF黏膜黏附层的平均厚度为400 μm，而背衬层的平均厚度为30 μm。较厚的黏附层可以增加黏膜处的保留时间，并荷载更大量的活性成分。然而，也会导致制剂更容易从黏膜上脱落。背衬层可作为屏障防止活性成分溶解到唾液中而损失，同时确保活性成分受控地、单向地释放。这不仅可延长薄膜在黏膜表面的附着时间，还能够增强抗原的渗透性。研究团队采用流通式溶解装置评估了背衬层对薄膜溶解时间的具体影响（图1F）。实验结果表明，背衬层对黏附层中活性成分的溶出速率和溶出时间有明显影响。30 min后，没有背衬层的MAF 释放了95%以上的RFP，而带有背衬层的MAF溶解速率较慢，释放时间得到明显延长。为了确认乙基纤维素背衬层的非渗透性，研究团队倒置了双层膜，使不透水层暴露在溶解介质上。倒置的薄膜在最初的几分钟内释放了大约10%的RFP，这可能是由于薄膜边缘蛋白质的横向释放。此后，蛋白释放率在一小时的实验时间内维持恒定，证实背衬层未发生泄漏。
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（E）MAF的扫描电子显微镜照片;（F）双层MAF、无背衬层的MAF与倒置双层MAF的体外溶出曲线。研究团队将编码增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的重组腺病毒掺入MAF中，评估其能否将病毒载体递送至黏膜。实验结果表明，掺入病毒载体的MAF在小鼠口颊黏膜施用后能够从制剂中释放并保持其活性。贴膜 24小时后，小鼠口腔周围局部区域的eGFP表达最高，表明制剂能够有效递送至目标区域并引起基因表达（图2B）。为评估制剂的生物安全性，研究团队对小鼠进行了鼻内、口服、口颊黏膜免疫，并通过脑部荧光成像评估每组eGFP的表达水平。鼻内给药组的五只小鼠中有两只在大脑中观察到eGFP 荧光，而MAF组小鼠脑中仅检测到少量荧光，各组eGFP量未表现出显著性差异（图2E）。而后作者使用MAF荷载了编码SARS-CoV-2受体结合域（RBD）与寡聚β环结构域（RBD-bann）融合蛋白的腺病毒载体，并在小鼠口颊处接种。抗体数据表明， MAF成功诱导了RBD -bann特异性IgG的产生（图2F）。
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图2. 荷载重组腺病毒的MAF稳定性与生物安全性评估而后，研究团队使用MAF荷载LNP。电镜结果表明，装载在MAF黏附层中的LNP结构保持完整（图3A）。此外，MAF在4 ℃储存一个月后，mRNA损失了约17%，与mRNA/LNP相似，表明掺入MAF不会影响mRNA的稳定性（图3B）。进一步地，小鼠体内研究表明mRNA/LNP经MAF黏膜递送后其有效性和生物活性得到了保留（图C）。
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图3. 荷载mRNA/LNP疫苗的MAF经口颊黏膜递送为确定MAF疫苗接种的疗效，研究团队使用编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA/LNP（3 μg mRNA）免疫小鼠，然后间隔21天进行两次加强免疫。最后一次免疫后，首次肌肉免疫（IM-MAF-MAF）组小鼠产生的IgG抗体水平与接受三次肌内注射（IM-IM-IM）的小鼠相近（图4B）。为进一步研究制剂对SARS-CoV-2感染的保护作用，研究团队评估了免疫动物血清样本的中和抗体水平。IM-IM-IM、IM-MAF-MAF和MAF-MAF-MAF组的所有血清均中和了SARS-CoV-2病毒（图4C）。IM-IM-IM组表现出最有效的中和作用，IC50为1：9000。细胞毒性CD8+ T反应的结果与EPTs一致，IM-IM-IM表现出最高的特异性细胞裂解率，其次为IM-MAF-MAF组（图4D）。然而，相比于IM-IM-IM肌肉免疫途径而言，IM-MAF-MAF引起了更高水平的黏膜IgA分泌，意味着异源疫苗接种策略在增强粘膜免疫方面的潜在益处（图4F）。以上实验结果均证明了MAF可以提高小鼠中和抗体与黏膜抗体水平，激活细胞毒性淋巴细胞，表现出良好的免疫效果。
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图4. 编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA/LNP免疫方案与抗体水平测定最后，研究团队评估了MAF作为DNA质粒疫苗递送平台的潜力。然而，由于DNA不具有与脂质纳米颗粒和病毒载体相同的跨上皮屏障摄取和转运机制，因此MAF中需要添加额外的渗透增强剂，以提高组织通透性并增强DNA在靶组织内的分布。研究团队发现，含有1 % Tween 80 的制剂在增强渗透性方面比 STGC 更有效，其荧光素酶表达水平显著升高（图4G）。此外，掺入质粒的MAF可以在室温下储存一个月以上而不会失去活性。
综上，MAF成功诱导了小鼠局部黏膜和全身免疫反应，并且可用于包括病毒、DNA和mRNA/LNP等多种类型在内的疫苗递送平台。通过与肌肉注射疫苗基础免疫相结合，MAF疫苗可作为加强免疫持续性增强免疫效果。MAF可以增强疫苗效用，提高患者依从性，并有助于减少与传统疫苗接种方式相关的恐惧心理。- 开发了经口颊黏膜递送的MAF，可以荷载病毒、DNA和mRNA/LNP等多种类型疫苗；
- MAF诱导了与肌肉注射相当的抗体水平与细胞免疫反应，并显著提高了黏膜sIgA的分泌；
- MAF具有良好的生物安全性，有望降低患者接种疫苗的心理障碍，提高疫苗的接受度和可及性。
Volume 371, July 2024, Pages 179-192
https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2024.05.041
Roman Jerala，化学科学博士，卢布尔雅那大学生物化学和分子生物学教授，斯洛文尼亚国家化学研究所合成生物学和免疫学系主任，于2017年当选为欧洲科学院院士。Roman Jerala团队的主要研究方向是合成生物学和分子免疫学。合成生物学的主要领域包括（一）生物纳米结构设计（螺旋-螺旋蛋白质折纸），（二）哺乳动物细胞信号传导和信息处理的工程化，以及（三）合成生物学的医学应用。先天免疫领域的研究主要集中于Toll样受体和MyD88信号转导的分子机制。
信息来源：https://www.ae-info.org/ae/Member/Jerala_Roman；https://people.embo.org/profile/roman-jerala
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供稿 | 游丞铮
审校 | 孙 逊
编辑 | 谢明心
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