非肥胖型与肥胖型非酒精性脂肪肝血清脂质组学研究
【摘要】目的 比较非肥胖型与肥胖型非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)血清脂质谱的差异。方法 纳入2023年1月至12月上海市公共卫生临床中心诊治的NAFLD患者60例,根据BMI分为非肥胖型组(BMI<25kg/m2)和肥胖型组(BMI≥25kg/m2)。超高效液相色谱-质谱检测非肥胖型NAFLD和肥胖型NAFLD患者的血清脂质代谢物。采用差异倍数、偏最小二乘判别(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)并进行置换检验,筛选差异脂质。结果 共筛选出90种差异脂质。包括鞘磷脂(SM)、醚甘油磷脂酰胆碱(EtherPC)、神经酰胺(HexCer)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。KEGG通路富集分析显示非肥胖型NAFLD患者的一些代谢途径发生明显变化,包括鞘脂信号通路、坏死性凋亡、甘油磷脂代谢通路、糖基磷脂酰肌醇的合成途径、肿瘤的胆碱代谢通路等。结论 非肥胖型NAFLD和肥胖型NAFLD的血清脂质谱存在一定差异,包括PC、PE、SM等。
【关键词】非酒精性脂肪性肝病;脂质组学;肥胖
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一类与代谢紊乱及遗传易感相关的肝损伤。肥胖是NAFLD的重要危险因素。但有一部分NAFLD患者BMI处于正常范围,称之为非肥胖型NAFLD。我国非肥胖型NAFLD的发病率为4.2%～19.3%,占NAFLD的20%～56%[1]。有研究者观察了1000多例非肥胖型NAFLD患者的疾病预后,发现该部分患者的病死率高达28%。此后,非肥胖型NAFLD逐渐受到越来越多的关注[2，3]。非肥胖型NAFLD和肥胖型NAFLD的致病机制可能不尽相同。脂质组学作为代谢组学的重要组成部分,为现代疾病的研究提供了有利条件[4]。
本研究探讨非肥胖型NAFLD和肥胖型NAFLD患者的血清脂质代谢规律和特点。
资料与方法
一、研究对象
纳入2023年1月至12月在上海市公共卫生临床中心诊治的NAFLD患者60例,根据BMI分为非肥胖型组(BMI<25kg/m2)和肥胖型组(BMI≥25kg/m2)。本研究经上海市公共卫生临床中心伦理委员会审批(2022-S106-02)。
纳入标准:符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南 (2018年更新版)》[5]诊断标准。排除标准:年龄<18岁,合并自身免疫性肝病、病毒性肝炎、酒精性肝病、遗传代谢性肝病、肠外营养及服用可导致肝脏脂肪变性的药物(胺碘酮、泼尼松、丙戊酸钠等)。
二、临床资料收集
收集患者的一般资料:性别、年龄、BMI、腰围、臀围;生化指标:ALT、AST、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹血糖(GLU)。
三、标本采集和预处理
采集空腹肘静脉血3mL,离心分离血清,-80℃保存。检测前将样品于4℃解冻,每个样品取20μL,加入200μL预冷的含有10mmol/L甲酸铵的丁醇/甲醇溶液,涡旋震荡;在冰浴中超声萃取60min,4℃ 16000×g离心20min,取适量上清进样分析。质控样本的制备:等量取各组样本混合,用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统,以及用于评价整个实验过程中系统稳定性。
四、超高效液相色谱-质谱分析
色谱条件:进样量 5μL,柱温40℃,流速0.3mL/min;流动相组成A: 0.77g甲酸铵、乙腈∶水=6∶4,B:乙腈∶异丙醇=1∶9。梯度洗脱程序如下:0～2min,B从30%线性变化至32%;2～6min,B从32%线性变化至45%;6～8min,B从45%线性变化至52%;8～12min,B从52%线性变化至58%;12～15min,B从58%线性变化至66%;15～18min,B从66%线性变化至70%;18～21min,B从70%线性变化至97%;21～25min,B维持在97%;25～26min,B从97%线性变化至32%;26～30min,B维持在32%。
质谱条件:分别采用电喷雾电离正离子和负离子模式进行检测。
五、统计学方法
使用软件 MSDAIL 4.0.9进行LC-MS/MS数据处理,包括峰对齐、峰提取和归一化等。使用UV-scaling软件对脂质组学数据预处理后进行多维统计分析,包括主成分分析(PCA)分析和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。采用SPSS26.0统计软件进行数据分析。非正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示,两组间比较采用Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、临床资料分析
60例NAFLD患者中,非肥胖型NAFLD 27例,男性13例,女性14例;肥胖型NAFLD 33例,男性20例,女性13例(χ2=0.931,P=0.335)。两组患者的年龄、性别构成、WHR比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。非肥胖组的AST水平低于肥胖组,差异有统计学意义(P=0.019),余指标差异无统计学意义(均P>0.05),见表1。
二、脂肪组学数据处理
将数据预处理后进行PLS-DA分析,同时采用OPLS-DA模型验证(图1)。结果可见非肥胖型NAFLD和肥胖型NAFLD组间明显聚集,分离良好,表明非肥胖型NAFLD和肥胖型NAFLD的脂质谱存在明显差异。模型拟合指数R2=0.696,预测指数Q2=-1.41,说明建立模型的拟合能力和预测能力良好。
A:PLS-DA得分图;B:PLS-DA置换检验图;C:OPLS-DA得分图;D:OPLS-DA置换检验图;蓝色为肥胖组;红色为非肥胖组
图1 得分图及置换检验图
三、脂质差异分析
为了找出非肥胖组和肥胖组的差异性脂质,根据OPLS-DA的结果,设置参数VIP>1、P<0.05和差异倍数FC>1.5或FC<0.67为筛选条件。最后鉴定出90种差异脂质,包括14种脂肪酰(FA),29种甘油磷脂(GP), 34种鞘脂(SP),4种甘油脂(GL),2种甾醇酯类(ST)(图2A);亚分类显示鞘磷脂(SM)、醚甘油磷脂酰胆碱(EtherPC)、神经酰胺(HexCer)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)差别种类较多(图2B)。
A:差异脂肪分类统计环形图;B:差异脂质亚分类统计环形图
图2 差异脂肪分类
四、差异脂质的通路和富集分析
基于90种差异脂质绘制了热图(图3A)。为了更好地反映脂质分布差异,根据VIP值选取前50位差异分子绘制了热图(图3B)。其中,前10位差异表达的脂质分子分34是PC6:0_32:6、PE38:4、SE21:1;04、NAGlySer 15:3;0、PC34:2、PC36:2、PC38:4、PC0-32:0|PC0-16:0_16:0、SM42:1;02、PC34:2;03|PC16:0_18:2;0。
A:差异脂质聚类分析;B:VIP前50差异脂质聚类分析
图3 聚类分析
采用 KEGG 代谢网络富集分析以识别紊乱的代谢途径(图4)。结果显示,相较于肥胖型NAFLD的患者,非肥胖型NAFLD患者的一些代谢途径发生明显变化,包括鞘脂信号通路、坏死性凋亡、甘油磷脂代谢通路、糖基磷脂酰肌醇的合成途径、肿瘤的胆碱代谢通路等。
图4 KEGG富集分析
讨 论
NAFLD是代谢综合征累及肝脏的表现。多数情况下,NAFLD发生与营养过剩和肥胖有关。但有研究表明,非肥胖型NAFLD患者中39.0%发生NASH,29.2%发生显著肝纤维化,3.2%进展为肝硬化,而肥胖型NAFLD患者的发生率分别为52.9%、38.3%和2.0%[6]。
脂质代谢研究计划将46 686种脂质分为8大类,即甘油酯类、甘油磷脂类、异戊烯醇类、聚酮类化合物、脂肪酰类、鞘脂类、固醇酯类、甾醇脂类和糖脂类。对健康人群及NASH患者的肝组织进行脂质组学分析,结合机器学习方法得到了32种能够以100%敏感性和特异性区分NASH的脂质,主要为脂肪酸、三酰甘油、磷脂、鞘脂[7]。Loomba等[8]应用LC-MS/MS分析单纯性脂肪肝、脂肪酰甘油和正常人群血浆中的26种类二十烷酸,找到了可以区分脂肪性甘油和单纯性脂肪肝的9种脂质标志物。有研究报道联合DAG、TAG和SM有助于诊断NASH[9]。本研究发现非肥胖型和肥胖型NAFLD的差异脂质主要为 GP、SP 、FA 、GL,其中PC、PE、SM最为显著。
PC和PE是细胞中含量最丰富的磷脂。其中,线粒体内膜上PE约占总磷脂的40%[10]。PC的合成及分泌与极低密度脂蛋白(vLDL-C)相互关联,PC合成功能障碍将导致vLDL-C的合成及分泌减少,最终使得TG不能转运出肝脏[11]。目前关于甘油磷脂在NAFLD患者体内分布情况的研究结论不尽相同。Puri等[12]研究发现相对于正常对照组,肝脏总PC水平在NAFL及NASH组明显降低。而有研究得出相反的结论,发现循环PC水平在NAFL和NASH患者明显升高。
SM 和 Cers 是细胞膜的鞘脂和结构成分。鞘脂同样是生物膜的重要构成部分,其中Cer作为鞘脂类代谢过程种较为重要的中间产物,在NAFLD疾病进程中发挥作用。越来越多的证据表明,鞘脂不仅与 NAFLD 的发生和组织学进展有关,还与糖尿病的发病有关[13]。动物 NAFLD 模型证实,SM 和 Cers 水平升高可能通过诱导非肥胖 NAFLD/NASH 的炎症和细胞凋亡而促进肝脏纤维化[14]。Jung等[9]进一步研究发现,SM d36:0、SM d38:0和 SM d40:0的水平仅在非肥胖组中与VAT显着相关,推断这些独特的循环脂质可作为诊断非肥胖 NAFLD 的替代标志物。
综上所述,非肥胖型NAFLD和肥胖型NAFLD的血清脂质谱存在差异,包括PC、PE、SM等。非肥胖型NAFLD和肥胖型NAFLD的发病机制可能不尽相同,现有研究结果存在一定差异。本研究样本量较小,可能存在生活方式等混杂因素,需进一步开展大样本的前瞻性临床试验,探讨脂质代谢紊乱在非肥胖型和肥胖型NAFLD患者中的潜在作用机制。
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