一、自噬的概述

自噬是维持细胞稳态的过程。在自噬中,自噬体将老化或受损的细胞器、错误折叠或无用的蛋白以及细胞病原体转移到溶酶体进行降解[3]。自噬主要分为三种类型:大自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬(CMA)[4]。自噬在生理条件下维持肝脏细胞和代谢稳态方面发挥着重要作用。首先,肝脏中包括氨基酸、葡萄糖和脂质在内的营养物质的波动受到昼夜节律调节,并且肝自噬表现出与身体营养状态的波动相协调的节律行为[4]。此外,当机体缺乏营养时,肝自噬被激活,使得某些营养物质分解代谢为葡萄糖、脂肪酸和氨基酸供应给肝细胞,并为其他器官提供葡萄糖[4]。自噬除了在生理条件下发挥作用外,也可影响病理状态的发生和发展过程。例如,自噬可通过调节AMPK-mTOR途径抑制LPS诱导的NLRP3炎性小体活化,从而抑制炎症反应[5]。同时,自噬也可以促进脂质代谢,抑制了非酯化脂肪酸在细胞内的蓄积,减轻了脂肪变性和肝炎[6]。此外,自噬与干扰素诱导蛋白联合作用,使得自噬体与乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合,导致病毒蛋白降解,从而减缓慢性乙型肝炎的进展[7]。总而言之,自噬对肝脏疾病防治至关重要,激活自噬能够有效减轻肝脏损伤,减缓肝脏疾病的发展。

二、自噬在ALD中的作用

越来越多的证据表明,自噬水平的变化可能与酒精引起组织损伤和相关疾病的发生有关。但酒精对自噬水平的影响却不尽相同。酒精既可激活自噬以清除受损的线粒体和累积的脂滴,也可以表现出对自噬的显著抑制。一般来说肝脏自噬水平在酒精摄入早期被激活,而长期摄入酒精导致自噬抑制[8],这可能是机体应对酒精损伤的代偿和失代偿的不同阶段和状态。而ALD可因自噬的进一步抑制而加重,也可因自噬的激活而得到改善[8]。

已有研究表明,酒精摄入的早期激活肝脏自噬。Ding等[9]在酒精喂养早期的小鼠中发现,小鼠肝脏中GFP-LC3斑点显著升高,GFP-LC3的膜结合PE缀合形式和内源性LC3增加。同时,LC3富集于溶酶体膜上,其反映了自噬体(AV)与溶酶体融合以形成自噬溶酶体。进一步通过电子显微镜分析发现自噬体数量明显增加[9]。类似地Chen等[10]也在酒精喂养早期的小鼠肝脏中发现LC3-Ⅱ的表达以及LC3的转化率(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)明显增高。在细胞实验中,Wang等[11]采用永生化小鼠肝细胞系AML12观察到,GFP-LC3在短期酒精处理后聚集形成斑点。以上这些研究表明了酒精摄入早期可以提高自噬水平。酒精可以通过不同的机制激活自噬。自噬的激活与乙醛、mTORC1复合物、FoxO3a和TFEB有关。酒精可通过细胞色素P4502E1(CYP2E1)代谢为乙醛,并在此过程中引起电子泄漏产生ROS。Chen等[10]通过酒精喂养早期的小鼠发现,酒精主要通过诱导酶系统,如CYP2E1或NOX4,增加ROS的产生,激活自噬。mTORC1复合物是调控自噬的重要分子。正常情况下mTORC1与ULK 1/ULK 2复合物结合,并通过其磷酸化使复合物失活,从而抑制自噬。Ding等[9]发现,采用原代肝细胞,酒精处理能够减少下游磷酸化p70S6激酶和4E-BP1(mTOR的两个主要下游靶标),引起mTOR的剂量依赖性抑制。上述研究证实酒精可以通过抑制mTOR活性,从而诱导自噬。溶酶体是细胞的终末降解细胞器,通过与AV融合来确保自噬过程的完成。TFEB是溶酶体发生的主要调节器,TFEB也与酒精诱导激活自噬有关。Trambly等发现酒精喂养小鼠肝细胞中能够增加核TFEB的含量,而自噬的增强与较高水平的核TFEB相关[12]。Ni等[13]发现FoxO3a介导的自噬相关基因转录在酒精喂养早期的小鼠肝脏和短期酒精处理的原代肝细胞自噬中起关键作用,证实酒精能够抑制Akt介导的FoxO3a磷酸化,引起细胞核FoxO3a滞留,从而提高自噬基因的表达,激活自噬。

尽管酒精摄入早期能够提高自噬水平,但大量研究表明,持续长期酒精摄入可以抑制自噬。Wang等[14]通过长期酒精喂养的小鼠发现,肝组织和原代肝细胞有自噬颗粒形成,但肝细胞中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ减少,肝组织出现损伤和脂肪变性。Shi等[15]在长期酒精处理的AML-12细胞中观察到AV形成增加,但很少发现自噬溶酶体。这表明自噬过程被中断,自噬受到抑制。Thomes等[16]认为长期酒精摄入使得酒精进入肝脏通过ADH催化为乙醛,引起了LC3-Ⅱ的积累,增强了肝细胞中的AV含量,但是同时也抑制了蛋白酶体和溶酶体对AV的降解。此外,Zhuge等[17]在长期酒精喂养的小鼠肝细胞中发现,p62表达水平升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低。上述结果表明了长期酒精摄入能够下调肝脏自噬水平。酒精也可通过多种途径抑制肝脏自噬过程,主要与乙醛、CYP2E1、TFEB、外泌体和游离脂肪酸(FFA)等有关。在长期酒精摄入期间,酒精氧化代谢产生的乙醛与微管蛋白形成加合物,阻断微管的细胞内聚合并阻止AV与溶酶体融合,引起AV与蛋白质积聚,导致肝脏脂肪变性和肝肿大[18]。此外,Wu等[19]分别采用敲入(KI)和敲除(KO)小鼠CYP2E1进行长期酒精喂养,发现野生型和KI小鼠中出现脂肪肝,CYP2E1升高,自噬受损,而KO小鼠未发生这些变化。同时细胞实验发现,高表达CYP2E1的HepG2细胞中有着严重的脂肪累积。这些结果表明,长期酒精暴露能够引起CYP2E1增加,从而抑制自噬,导致酒精性脂肪肝。此外,已有文献证实长期酒精摄入虽然增加了肝脏中AV的数量,但却减少了溶酶体的数量,引起自噬流的阻断,最终导致自噬水平下降[15]。在Chao等[20]的研究中发现,长期酒精喂养小鼠肝脏中总TFEB、核TFEB和TFEB的mRNA水平降低,肝脏溶酶体数量减少30%,这说明酒精通过降低TFEB蛋白及其肝脏中的转录活性,减少溶酶体数量,抑制自噬。酒精被证明能够诱导小RNA如miR-155等的表达,通过靶向抑制溶酶体膜相关蛋白Lamp1和Lamp2,损害自噬并促进酒精诱导的肝脏脂肪变性和炎症[21]。长期饮酒还会引起脂肪组织释放游离脂肪酸(FFA),增加肝脏中FFA的累积。Guo等[22]通过长期酒精喂养的小鼠发现,肝脏FFA通过激活mTORC1信号转导,从而诱导内质网应激,抑制自噬。此外,酒精诱导的自噬抑制也可能是由于肝脏氨基酸的改变,如一些调节性氨基酸包括亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和组氨酸等,它们能够抑制巨细胞自噬[23]。

综上所述,在酒精摄入所致ALD的过程中,酒精摄入早期可以提高自噬水平,而持续长期酒精摄入能够降低自噬。对于不同时期的肝自噬水平差异,其原因可能主要是由于酒精喂养时间、剂量和频率等因素,使得身体对酒精引起的肝脏毒性由代偿期向失代偿期转变,从而抑制肝脏的自噬水平。此外,酒精能通过多种途径提高或抑制自噬水平,这对我们进一步探讨ALD的发生机制和防治方法提供了新的线索。

三、选择性自噬在ALD中的作用

自噬可以根据被降解的货物分为非选择性自噬和选择性自噬。选择性自噬是一种高特异性的降解过程,用于清除特定受损的细胞器、蛋白质聚集物和入侵的病原体[24]。这一过程主要依赖于特定的自噬受体或适配器,它们能够识别货物并与自噬体相互作用,最终被溶酶体降解[25]。选择性自噬靶向的细胞组分,包括聚集蛋白(聚集性自噬)、线粒体(线粒体自噬)、过氧化物酶体(过氧化物自噬)、核糖体(核糖体自噬)、内质网(网状自噬)、脂滴(脂肪自噬)、糖原(糖自噬)和病原体(异源自噬)等[25]。酒精诱导的自噬已显示对去除肝脏中受损的线粒体和脂肪具有选择性[26]。因此,选择性线粒体自噬和脂肪吞噬途径有助于改善酒精引起的代谢紊乱,恢复肝功能,从而减轻ALD。

(一)线粒体自噬在ALD中的作用 线粒体自噬是一种针对线粒体特异性自噬过程,有助于清除受损、功能失调和潜在细胞毒性的线粒体。通过线粒体自噬及时和准确的清除受损和多余的线粒体,以应对营养缺乏、线粒体受损和细胞质的重塑的需求,从而维持细胞内稳态和功能[27]。越来越多的证据表明,线粒体自噬通过清除功能失调的线粒体,在ALD中发挥保护作用,而线粒体功能障碍是ALD发病的关键之一。研究表明,线粒体自噬能够通过减少氧化应激并保留呼吸链和线粒体生物能量用以产生能量来防止细胞死亡。线粒体自噬还通过维持线粒体群体的β-氧化来防止肝脏中的脂质累积[28]。慢性饮酒后,过度和持续的线粒体吞噬负荷导致紊乱的自噬处理,并且可能释放线粒体损伤相关分子模式以激活介导的炎症和促纤维化反应[27]。目前研究仍未弄清楚酒精调节自噬的机制。Parkin是线粒体自噬激活的主要调节器。Williams等[29]使用野生型和Parkin敲除(KO)小鼠建立酒精喂养模型发现,酒精处理后,与野生型小鼠相比,Parkin KO小鼠线粒体形态学发生改变,线粒体呼吸和COX活性降低。同时,观察到酒精处理Parkin KO小鼠线粒体自噬减少。此外,一些蛋白和酶也可通过激活Parkin信号通路从而调节线粒体自噬。Li等通过建立长期酒精喂养小鼠模型发现,酒精可以下调双特异性磷酸酶-1(DUSP1)的表达水平,阻碍与E3泛素-蛋白连接酶复合物Cullin-1(CUL1)结合,从而抑制Parkin的转录,导致线粒体自噬抑制[30]。酒精调节线粒体自噬还可能与锌指蛋白281(ZNF281)有关。Lu等通过建立长期酒精喂养小鼠模型发现ZNF281在正常肝细胞中低表达。当用酒精刺激时肝细胞中的ZNF281表达上调,抑制HK2的表达,使HK2介导的PINK1-Parkin线粒体自噬抑制[31]。此外,Lu等发现长期酒精处理的动物模型和细胞模型中泛喹啉-细胞色素c还原酶核心蛋白2(UQCRC2)低表达并且线粒体自噬受损,而使用AMPK激动剂二甲双胍可显著上调UQCRC2蛋白水平,恢复线粒体自噬[32]。

(二)脂噬在ALD的作用 脂噬被描述为一种专门用于降解脂滴(LD)的自噬形式[24]。当发生脂噬时,自噬体吞噬胞质中的LD并转运至溶酶体,在溶酶体中三酰甘油和其他脂质通过溶酶体酸性脂肪酶进行酸性脂解[33]。脂噬能够保护酒精引起的肝细胞脂肪变性已得到广泛证明。Eid等酒精喂养大鼠10周,通过光学显微镜和电子透射显微镜(TEM)显示酒精处理的大鼠肝细胞中存在明显的脂肪变性。进一步研究发现,脂肪变性与AV形成有关,LD是脂肪变性肝细胞中AV的主要成分,而TEM显示肝细胞中AV增加。对于上述结果他们认为,酒精可以导致肝脏中LD增加,从而引起脂肪变性,而脂噬可能是改善脂肪变性的有效途径[34]。酒精能够抑制LD的脂噬,导致LD的清除障碍。Mcvicke等[35]使用酒精处理WIF-B细胞(人成纤维细胞和大鼠肝癌细胞的杂交瘤)证明乙醇氧化与受损的脂肪降解和LD有关,认为酒精抑制了脂噬。目前仍未完全研究清楚酒精对脂噬调节机制。酒精调节脂噬的机制可能涉及Rab7。Schulze等[36]发现在长期酒精喂养大鼠的肝细胞中积累了较高水平的脂肪,Rab7活性降低80%。用Rab7抑制剂处理导致饥饿诱导的LD分解减弱与单独的长期酒精喂养的LD分解水平相同,这说明酒精能够降低Rab7活性,抑制肝细胞的脂噬。此外,酒精也会损害Dyn2(一种参与内吞作用的GTP酶),它在自噬溶酶体重组过程中发挥着重要作用,以维持自噬。Dyn2活性抑制能够减少脂噬,导致肝脏脂肪变性[37]。

四、调节自噬防治ALD

ALD由于发病率高且缺乏有效的ALD治疗药物,是一个全球性的健康问题。既然自噬已被证明在ALD中发挥重要保护作用,那么通过药物调节自噬可能是极具前景的防治ALD的方法。已有研究报道某些临床药物或天然植物中的成分能够通过激活自噬来改善酒精诱导的肝损伤和脂肪变性治疗ALD。例如,Lin等在ALD模型建立完成后给予卡马西平(Carbamazepine)发现,治疗组小鼠肝自噬水平上调,ALD症状有所减轻[38]。Gao等[39]在ALD模型中给予人参皂苷,发现人参皂苷能够上调AMPK上游的STRAD和LKB1的蛋白水平,引起AMPK依赖性自噬激活,从而减轻肝脏脂肪变性。Atef等[40]在酒精喂养大鼠发生脂肪性肝炎后给予辛伐他丁(Simvastatin),发现治疗组大鼠肝脏中自噬水平上调,酒精性脂肪性肝炎症状有所缓解。Tang等在酒精喂养小鼠出现脂肪肝特征后给予白藜芦醇,他们发现小鼠肝脏中微管蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1增加, p62蛋白水平降低,肝脏自噬被激活,从而减轻酒精诱导的肝损伤和脂肪变性[41]。

此外,通过药物或天然植物中的成分激活自噬可以预防ALD。Lee等在酒精喂养小鼠前给予西洛他唑(Cilostazol),他们发现西洛他唑可以通过肝激酶B1(LKB 1)和钙/钙调素依赖性蛋白激酶2(CaMKK 2)活化,增加AMPK水平,引起自噬激活,减轻酒精引起的脂肪变性和细胞凋亡,降低ALD的发生[42]。Yang等[43]在酒精喂养小鼠前给予大麻二酚(CBD),发现大麻二酚可以通过减缓对酒精自噬的抑制,保护肝脏免受酒精诱导脂肪变性和肝损伤。Ma等[44]通过建立ALD模型同时给予小鼠熊果酸(UA),发现熊果酸通过AMPK途径诱导自噬,能明显改善酒精代谢,从而对酒精肝损伤发挥保护作用。Zhuge等[17]采用酒精和蓝莓多酚一起喂养小鼠,发现蓝莓多酚能够促进肝脏自噬,加速脂质代谢过程,从而预防ALD的发生。Shi等[15]在酒精喂养过程中给予丹酚酸A(SalA)灌胃处理,发现丹参中的SalA通过Sirtuin 1(SIRT1)介导恢复AV-溶酶体融合激活自噬,提高肝细胞的活力,减轻细胞凋亡和脂肪变性,从而减缓ALD的进展。Yu等[45]在酒精喂养过程中给予槲皮素灌胃处理,发现槲皮素通过上调AMPK和ERK2,促进线粒体自噬,从而减轻长期酒精摄入所致的肝线粒体损伤,预防ALD发生。

除了通过药物激活自噬防治ALD外,一些酶、miRNA和蛋白因子也可激活自噬对ALD起到保护作用。Zhang等发现酒精能够通过激活3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDPK1)抑制自噬,给予PDPK1靶向抑制剂,抑制PDPK1活性,能够上调自噬水平来保护肝脏免受酒精引起的脂肪变性和炎症反应[46]。Han等采用特异性miR-26a转基因小鼠酒精喂养,发现miR-26a过表达上调自噬水平,改善小鼠的酒精性肝损伤[47]。肝再生因子(ALR)已被证实可以激活自噬。Liu等采用特异性ALR转基因小鼠进行酒精喂养,发现ALR过表达能够抑制mTOR途径,促进自噬,从而发挥抗酒精肝损伤的保护作用[48]。上述这些研究表明,自噬是ALD防治的潜在干预靶点,通过药理学方法提高自噬水平可以改善酒精诱导的肝损伤和脂肪变性,改善ALD,这为ALD的防治提供新的方向。

五、总结

ALD是一种与长期饮酒有关的慢性疾病,其主要是由于酒精在代谢过程中的产物损伤肝细胞,导致肝脏逐渐发生病理改变的过程。自噬能够通过降解LD、清除受损的线粒体和蛋白聚集体等方式来减轻肝脏的脂肪变性和炎症等病理改变,维持肝脏正常的生理功能。自噬功能障碍是包括ALD在内的多种肝脏疾病的发病机制的主要因素之一。虽然酒精摄入对肝脏自噬的影响存在着一定的时间和剂量的效应差异,但持续的酒精暴露能够通过多种机制损害溶酶体功能或溶酶体生物合成,导致肝细胞自噬受损。因此,通过药理学方法提高或恢复自噬功能是ALD的一种极具潜力的防治策略,基于自噬调控靶点也是研发治疗ALD药物的新方向。但目前酒精对自噬的时间剂量效应关系以及与ALD的临床病理改变的相关性了解不多,每个具体阶段调控自噬及选择性自噬的分子机制还不清楚,酒精特异性的自噬调控靶点仍需进一步探索,这些问题的阐明对于未来通过调控自噬防治ALD具有重要意义。