直接抗病毒药物治疗失败的慢性丙型肝炎患者临床特点及基因型分析
【摘要】目的 探索直接抗病毒药物(DAA)治疗失败的慢性丙型肝炎(CHC)患者的临床特点及基因型特征。方法 选取2021年9月至2022年12月咸阳市第一人民医院DAA治疗失败的患者28例,同时期DAA治疗成功者100例。酶法检测肝功能、PCR-反向杂交法检测HCV基因型、Sanger测序法检测耐药相关替代突变(RAS)片段,分析DAA观察组患者临床特征及基因型特点。结果 失败组和有效组HCV RNA>105 IU/mL分别为23例(82.1%)、34例(34.0%),差异有统计学意义(χ2=20.526,P=0.001)。DAA治疗失败组男性患者TBil、DBil分别为14.61(10.98,20.78)μmol/L、4.94(3.08,7.48)μmol/L,均高于女性患者的6.65(4.90,8.40)μmol/L、2.50(1.78,3.07)μmol/L(Z=-2.018和-2.456,均P=0.01)。纳入患者共检测出3种HCV基因型,分别为1b、2a及3b,有26例未测出基因型,失败组HCV 1b、2a及3b基因型分别为11例(39.3%)、6例(21.4%)及5例(17.8%),有效组分别为56例(56.0%)、15例(15.0%)及9例(9.0%)。失败组检测出NS5A和NS5B2种基因片段,但是RAS发生率不同。 结论 DAA治疗失败者会受性别、病毒载量、基因型以及RAS种类影响。
【关键词】抗病毒药物(DAA);慢性丙型肝炎;基因型;耐药相关替代突变(RAS)
HCV与宿主免疫反应之间的相互作用在病毒持续存在和疾病进展中起着重要作用[1，2]。目前慢性丙型肝炎(CHC)患者使用直接抗病毒药物(DAA)是首选治疗,但是仍有约5%的患者会治疗失败[3]。目前初步认定与病毒基因型和血清病毒基因序列上的耐药相关替代突变(RAS)种类有关[4]。本研究探讨DAA治疗失败CHC患者临床特点及基因型特点。
资料与方法
一、病例来源
纳入2021年9月至2022年12月咸阳市第一人民医院收治DAA治疗失败患者28例,其中男18例,女10例,年龄34～67岁;选取同时间DAA治疗成功者100例,其中男67例,女33例,年龄39～62岁。患者CHC诊断参照文献[5]。
二、RNA提取
将Trizol裂解液加入待测血清,提取RNA,最后加入DEPC水进行检测。于全自动酶标仪检测RNA浓度,将RNA浓度调整为合适浓度以便进行后续操作。
三、HCV基因型检测
将PCR反应液加入含有RNA的EP管中,加石蜡油振荡混匀,离心,上机,并取部分扩增物行琼脂糖凝胶电泳,在多色荧光化学发光成像系统查看结果。
四、肝功能检测
日立7600全自动生化仪检测直接胆红素(DBil)、间接胆红素(TBil)、谷氨酰转移酶(GGT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)。
五、RAS片段检测
提取患者血液或组织样本中的病毒DNA。生工生物工程股份有限公司(上海)设计合成特定引物。对DNA样本进行PCR扩增,得到目标片段的多个拷贝。鉴定为阳性产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行sanger测序。Sequencher5.4.6软件将得到的序列与基因组参考序列进行比对,识别出可能的突变位点。
六、治疗方法
根据指南[6]标准,失败组28 例患者中,1b型6例采用百立泽/速维普方案、2a型5例采用索磷布韦/维帕他韦方案,3b型5例采用丙沙通方案,未检测出基因型6例采用依巴司韦/名格佐普韦方案;有效组100例患者中,1b型56例采用百立泽/速维普方案或索磷布韦/维帕他韦方案、2a型15例采用索磷布韦/维帕他韦方案,3b型9例采用丙沙通方案,未检测出基因型20例采用依巴司韦/名格佐普韦方案或索磷布韦/维帕他韦方案。均采用口服方式,1片/次,1次/d,疗程12周。
七、统计学分析
使用SPSS 25.0进行统计分析。计数资料以例数表示,比较用卡方检验,偏态分布的计量资料以M(P25,P75)表示,比较采用曼-惠特尼U检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、2组患者临床特征比较
28例治疗失败患者HCV RAN >105 IU/mL 23例,其中伴有糖尿病14例,脂肪肝12例,输血史14例。100例治疗有效患者HCV RAN >105 IU/mL 34例,其中伴有糖尿病51例,脂肪肝45例,输血史34例。两组患者的性别、年龄、TBil、DBil、AST、ALT、GGT以及并发症等差异无统计学意义(P>0.05),失败组HCV RAN >105 IU/mL的比例显著高于对照组(P<0.05),见表1。
二、治疗失败组不同性别生化指标比较
治疗失败男性患者的TBil和DBil高于女性(P<0. 05),而AST、ALT及GGT无明显差异(P>0.05),见表2。
三、2组患者基因型分布
纳入患者共检测出3种HCV基因型,分别为1b、2a及3b,有26例患者基因型未测出,其中失败组6例,有效组20例。2组患者基因型分布见表3。
四、DAA治疗失败组治疗方案及RAS分布
DAA治疗失败组共扩增出NS5A和NS5B 2种片段,治疗方案和各RAS分布见表4。
讨 论
HCV特异性免疫反应在病毒控制中起主要作用[7]。在引入DAA之前,以干扰素为基础治疗,约有50%的治疗患者成功清除了病毒感染[8，9]。虽然新一代的DAA疗效良好,但是仍有一部分患者在出现治疗失败的情况,可能与患者自身情况、治疗方案、病毒基因型、RAS等因素相关[10，11]。
本研究发现HCV载量高的患者在接受DAA治疗后更容易失败,与既往研究结论一致[12]。同时发现DAA治疗失败的男性患者TBil及DBil普遍高于女性,提示可以尝试在不同性别之间进行不同的治疗方案,但是由于本研究纳入的病例数较少,还需要扩大样本进一步验证。目前DAA的靶点已经出现了RAS,病毒的基因型和药物均会导致RAS的发生[13]。本研究2组患者的基因型为1b、2a和3b,有部分未检测基因型。既往研究表明,百立泽/速维普方案主要适用于HCV-1b型患者,丙沙通主要治疗HCV-3a型,部分治疗失败的患者大部分都发生RAS[14]。NS5A、NS5B是DAA治疗的主要靶点,NS5A耐药相关多态性与临床治疗失败有关,单个NS5A缺乏主要的表型影响HCV对NS5A抑制剂易感性的多态性,其可能导致病毒学失败的原因是降低了NS5A抑制剂的耐药屏障[15]。目前NS5A的RAS主要包括L31M和Y93H突变。其中L31M主要对雷迪帕韦耐药,Y93H主要对达卡他韦耐药,这些突变是否增加抗病毒药物的疗效,有待于进一步研究[16]。NS5B抑制剂主要包括索非布韦和达赛布韦,其作用机制主要是通过竞争性结合核糖核苷三磷酸,阻断RNA的复制和结合特定分子产生变构效应阻止病毒复制[17,18]。目前NS5B的RAS包括S218和C316N,C316N是目前认为未达到持续病毒学应答的重要原因之一[19,20],本研究未检测到C316N。
综上,HCV高载量的患者接受DAA治疗更易失败,且男性患者治疗失败风险更高。对于存在RAS的患者,应该采取个体化的治疗策略,选择不同的DAA组合,以克服耐药性。研发新的DAA药物,能够有效应对各种RAS,是未来治疗的方向。
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