一、肝脏中的巨噬细胞

巨噬细胞作为肝脏中最丰富的免疫细胞,根据来源可分为两种不同的巨噬细胞亚群[3]。一种是来自卵黄囊的具有自我更新能力的组织常驻巨噬细胞(库普弗细胞),在肝脏稳态期间参与肝脏代谢,清除病原体,吞噬细胞碎片等过程[4]。另一种为单核细胞来源的巨噬细胞(MoMs),在感染期间或超过肝脏耐受时其被招募到炎症部位,触发保护性炎症反应以及创伤修复[5]。根据极化表型巨噬细胞可分为M1型(促炎型巨噬细胞)与M2型(抑炎型巨噬细胞),后续将M2型进一步细分四个亚型(M2a、M2b、M2c、M2d)[6]。但随着单细胞RNA测序技术发展,一种同时表现出M1型和M2型特征的CD11b+F4/80+Ly6Clow巨噬细胞亚群被发现[7],使得传统分型具有一定局限性。因此,在肝纤维化的后续研究中,如何更好地定义促纤维化与促纤维溶解的肝巨噬细胞亚群,仍需进一步研究。

二、肝脏巨噬细胞与肝纤维化

在肝脏的慢性损伤过程中,随着炎症免疫细胞的募集,进而激活HSCs,激活的HSCs/肌成纤维细胞通过增殖,分泌I型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原,导致肝纤维化的发生[8]。肝巨噬细胞在肝纤维化的募集、浸润、炎症反应、调控HSC细胞、调控ECM降解平衡等环节起着关键作用[9]。一项研究表明,通过阻断或耗竭浸润的巨噬细胞,能减少成纤维细胞数量和胶原的积累,从而延缓纤维化的进程[10]。而通过抑制MoM向肝脏募集也可以改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化[11]。在肝纤维化的急性炎症期,激活的库普弗细胞能通过促炎细胞因子、趋化因子等募集MoM至肝脏从而增强炎症反应[12]。被募集的巨噬细胞既能进一步破坏肝脏血管结构及肝细胞,从而诱导肝纤维化形成,也能吞噬损伤的肝细胞,促进肝再生,发挥抗纤维化作用[13]。库普弗细胞和MoM也能通过巨噬细胞M1/M2的表型平衡来调控肝星状细胞的凋亡与活化,进而影响肝纤维化进程。目前大多数研究表明,M1型可以促进CCl4诱导的肝纤维化,M2型巨噬细胞作用则相反[14]。例如,敲除C5aR1ko基因的代谢相关脂肪肝(MASH)小鼠模型中显示当巨噬细胞从M1到M2型转变时,肝纤维化得以减轻[15];被高迁移率族蛋白1(HMBG1)和纤维蛋白原样蛋白2诱导促进巨噬细胞M1极化时,肝纤维化情况会加重。也有少数研究表明M1和M2中都有促纤维化与促纤维降解的表型[16-18]。不仅如此,肝巨噬细胞还能通过自噬、代谢重编程等方式参与肝纤维化进程。

三、血小板

(一)血小板的起源与功能 血小板是由骨髓巨核细胞产生的无核小细胞碎片。当血小板被释放到血液中,主要参与止血、循环和监督血管环境[20]。除此之外,由于血小板的细胞器区存在致密颗粒、α颗粒、溶酶体三种主要的膜糖蛋白,它们能在血管生成、炎症、细菌和病毒感染、癌症、组织再生和纤维化中发挥作用[21]。

(二)血小板与肝纤维化 肝脏作为产生促血小板生成素(TPO)的主要部位,血小板与肝脏紧密联系[22]。目前研究表明,血小板在肝纤维化中发挥着双重作用,较高的血小板计数与较轻的肝纤维化相关[2],抗血小板治疗可预防肝纤维化的发生[23]。

研究表明,来自血小板颗粒的ATP/ADP和肝细胞生长因子(HGF)具有抗纤维化作用[24],其中ADP/ATP能降解成腺苷,腺苷灭活后的静态HSCs产生TGF-β和分泌ECM的能力降低,而HGF通过抑制HSCs活化和肝脏表达TGF-β来减轻肝纤维化。血小板与HSCs在体外共培养后,发现血小板活化和HGF释放,随后HSC中I型胶原转录水平下调,也为上述观点提供证据[25]。血小板还能促进血管内皮细胞产生白细胞介素6(IL-6),IL-6能与肝细胞表达的受体IL6R/gp130结合,直接刺激肝细胞SAT3信号通路诱导肝细胞去分化为具备再分化成肝细胞和胆管细胞能力的类肝前体细胞[26],促进肝脏再生。此外,由血小板储存的5-HT也具有抗纤维化作用,Polat等[27]发现,肝硬化小鼠模型中5-HT7受体mRNA表达水平下降,予以5-HT7受体激动剂后,肝纤维化与肝硬化都有一定程度的缓解,说明5-HT通过5-HT7受体结合发挥抗纤维化作用。

激活的血小板也能促进肝纤维化进展。当血小板中的5-HT与5-HT2B受体结合时[31],可以激活HSC的EPK和JunD信号通路,从而促进其转化生长因子β1(TGF-β1)的表达,进而加重肝纤维化。血小板中的TGF-β1通过TGF-β/SMAD信号通路,导致SMAD2/3磷酸化,磷酸化的SMAD2/3与SMAD4聚集成异源复合物,作用于HSC、肌成纤维细胞,调控基因表达,加重肝纤维化[28],而缺乏TGFβ1的血小板能减少造血干细胞中的纤维化信号和胶原合成来减轻CCl4诱导的肝纤维化[29]。此外,血小板源性生长因子(PDGF)与自磷酸化的PDGFR结合后激活Ras系统,从而激活双特异性丝裂原活化蛋白激酶N(MEK)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路,进而调节I型胶原、金属蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶水平,加重肝纤维化,YS等[30]观察到,肝纤维化中有丝分裂性PDGF-B完全由活化的血小板产生,抗PDGF-B单克隆阻断抗体和低剂量阿司匹林抗血小板治疗都可降低循环PDGF-B水平,并改善肝纤维化。

综上所述,血小板在肝纤维化中起到双重调控作用,不仅如此,血小板也能与巨噬细胞相互作用影响肝纤维化进程。

四、血小板通过调控肝巨噬细胞影响肝纤维化

(一)血小板调控肝巨噬细胞炎症反应 肝巨噬细胞的炎症反应是肝纤维化发生、发展的重要因素。血小板作为炎症反应的关键参与者,能通过自身的P-selectin与单核细胞P-选择素配体1(PSGL-1,CD162)直接接触,形成血小板-单核细胞复合体增强单核细胞的炎症活动;此外,激活的血小板分泌的血小板因子4 (PF4,CXCL4)能通过磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、脾酪氨酸激酶(SyK)和P38丝裂原激活激酶(MAPk)激活而诱导单核细胞吞噬并触发呼吸爆发增强炎症反应[2]。也能通过自身的微囊泡hsa-miR-223-3p转移抑制血小板-单核细胞的相互聚集减轻炎症反应[32]。不仅如此,血小板释放的前列腺素E2 (PGE2)与巨噬细胞中的PGE2受体结合后,会增加单核巨噬细胞中抗炎细胞因子IL-10的表达,IL-10进一步阻止肿瘤坏死因子α(TNFα)的释放,从而抑制促炎过程。血小板C型凝集素受体2 (CLEC-2)还能与巨噬细胞的平足蛋白(podoplanin,PDPN)直接结合,减少巨噬细胞浸润,减轻炎症反应[33]。

(二)血小板调控肝巨噬细胞极化 肝巨噬细胞的M1与M2表型能影响肝纤维化进程。当血小板P-selectin与PSGL-1聚集时会增加单核巨噬细胞表面膜活化复合物1 (Mac-1,整合素αMβ2,CD11b/CD18)的表达,血小板与Mac-1结合后通过向单核细胞传递信息使其向M1促炎型巨噬细胞进行分化倾斜[34]。此外,CXCL4能通过细胞外信号激酶1和2(ERK1/2)的磷酸化,介导单核细胞的存活和分化,HK等[35]发现,血小板分泌的CXCL4能激活促纤维化的SPP1+巨噬细胞,通过敲除CXCL4基因发现巨噬细胞-成纤维化细胞的串扰消失,表明CXCL4是促炎型巨噬细胞激活的关键。但也有研究表明,活化的血小板通过sCD40L/CD40和PSGL-1/CD62P与辅助性T细胞(Treg)相互作用,诱导巨噬细胞向M2型极化,并增加其NLRP3炎症小体的泛素化,减少巨噬细胞中IL-1β的释放以及caspase-1的产生,发挥抗肝纤维化的作用[32]。

(三)血小板调控肝巨噬细胞的募集及分泌 当血小板与单核细胞形成血小板-单核细胞复合物后,该复合物通过ERK1/2MAPK通路引起细胞膜整合素构象改变,从而使其穿过血管向肝脏的Disse空间募集[36],进而增强后续的炎症反应促进肝纤维化。此外,血小板释放的趋化因子5 (CCL5/RANTES)可与中性粒细胞HNP1 (α-防御素)形成异源二聚体,通过CCR5刺激单核细胞的粘附,Alard等[37]证实,破坏HNP1-RANTES相互作用可减少单核细胞和肝巨噬细胞的募集。此外,研究表明PF4可以增强CCL5刺激的单核巨噬细胞在激活的内皮细胞上的滞留,CCL5则增强PF4与单核巨噬细胞表面的结合[38]。血小板表面受体CD40L与肝巨噬细胞的CD40相互作用,促使肝巨噬细胞释放基质金属蛋白酶MMP-9,MMP-9通过降解ECM,减轻肝纤维化[39]。另外一部分研究结果显示,血小板分泌的CCL5[2]可以通过Janus激酶(JNK)信号,导致单核细胞因子和趋化因子的产生和释放,如CC基序配体3和4(CCL3和CCL4),进而导致肝纤维化。

五、肝巨噬细胞调控血小板的清除及分泌影响肝纤维化

血小板的平衡是通过不断清除肝脏和脾脏中老化的、激活的或有缺陷的血小板以及骨髓中的巨核细胞不断产生新的血小板来实现。血小板的清除途径有[21、40]:(1)抗体介导的清除;(2)血小板糖基化介导的清除。其中去唾液酸化是血小板被清除的主要途径,去唾液酸化的血小板会被肝脏Ashwell-Morell受体(AMR)所识别,被识别的血小板最终被肝脏巨噬细胞清除。Li等[41]发现库普弗细胞可以吞噬小鼠模型中AMR和C型凝集素受体CLEC4F识别的溶解的血小板,后续研究中证明,在活体显微镜中显示血小板直接与库普弗细胞结合,会导致血小板被快速清除。库普弗细胞耗尽以及阻断AMR会导致循环中血小板聚集。此外,高度糖基化的GPIB-IX-V复合体在清除血小板方面起着重要作用[40]。一项研究证明GPIb参与血小板清除,激活GPIb的下游信号传导导致血小板颗粒释放,随后唾液酸酶如神经氨酸酶1 (Neu1)和3 (Neu3)在表面表达,导致血小板清除率增加[21]。而不依赖FC抗体介导的GPIbα激活可通过肝巨噬细胞快速清除[42],因此,肝巨噬细胞也参与糖基化介导的清除。当血小板与单核巨噬细胞结合后,巨噬细胞也进一步刺激血小板激活,并使其释放肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子-1,刺激肝细胞存活和分化[2],延缓肝纤维化进程。

六、小结与展望

血小板与肝巨噬细胞相互作用双向调控肝纤维化进程。目前靶向巨噬细胞治疗肝纤维化显示出良了好的前景,针对巨噬细胞治疗的策略主要为:(1)降低MoM和库普弗细胞的激活;(2)阻止MoM流入肝脏;(3)将巨噬细胞表型重编程为抗纤维化/促溶解表型。但其相关治疗效果仍有待进一步提高,仍需进一步探索影响巨噬细胞功能的相关因素。血小板可以通过直接的细胞相互作用和生长因子、细胞因子、趋化因子和其他介质的释放影响肝巨噬细胞的分化和极化,影响其促炎、促纤维化表型。提供血小板靶向治疗方法,特别是与肝巨噬细胞为目标的方法相结合,可以减少不良反应,提高肝纤维化的治疗效果。总之,阐明肝巨噬细胞和血小板之间的相互作用,以及可能涉及的其他免疫细胞,可能为开发肝纤维化的有效治疗开辟新途径。