干细胞来源的肝细胞体外肝病模型相关进展
【摘要】成体干细胞及多能干细胞相关技术的发展使我们能够在体外大规模扩增肝细胞。利用干细胞来源的肝细胞建立的肝病模型具有更便捷、更低成本的优势,并且可以忠实有效地在体外反映肝脏生理功能,模拟各类肝脏疾病,为我们深入探究肝脏疾病的病理机制提供了便利且高效的工具。
【关键词】成体干细胞;多能干细胞;肝细胞;体外肝病模型
我国有近4亿肝病患者(占人口总数25%～35%)[1],亟待肝病领域研究的进展与突破。原代人类肝细胞被认为是体外评估肝脏新陈代谢的金标准,但是由于原代肝细胞在体外失去增殖能力,其应用受到限制[2]。近年来,干细胞相关技术的发展为我们提供了新的肝细胞来源,利用干细胞来源的肝细胞建立的肝病模型,与动物模型相比具有更便捷、更低成本的优势,同时也能忠实地反映肝脏生理机能。
一、不同干细胞来源的肝细胞
肝细胞可由成体干细胞分化而来。研究表明,肝细胞和胆管上皮细胞都可能转化为成体肝脏干细胞参与损伤肝脏修复[3-4]。Huch等[5]开发了一种三维类器官培养方法,使Epcam+胆管上皮细胞去分化为具有肝-胆管双向分化潜能的成体干细胞,在体外能形成囊状三维结构,并持续扩增培养6个月以上;另外,有研究通过小分子重编程方法诱导肝细胞失去成熟肝细胞特性,也可获得成体肝脏干细胞[6-7];体外诱导得到的成体肝脏干细胞在平面或三维培养条件下均可重新分化为成熟的肝细胞[7-9],作为体外模拟肝病的种子细胞。
肝细胞也可由多能干细胞分化而来。多能干细胞包括胚胎干细胞及诱导多能干细胞,胚胎干细胞从人受精胚胎囊胚的内细胞团中分离出来,具有强大的增殖、自我更新及多向分化的潜能[10]。另外,通过诱导特殊的转录因子表达可以将成纤维细胞或血细胞等体细胞重新编程为类似胚胎干细胞的状态[11],这些细胞被称为诱导多能干细胞。胚胎干细胞与诱导多能干细胞均具有产生功能性肝细胞的潜能,通过重组生长因子或小分子的组合模拟肝脏发育的条件,可以促进多能干细胞向肝细胞分化[12]。
成体干细胞与多能干细胞提供了两种不同的在体外扩增获得肝细胞的途径,两种方法各有利弊。多能干细胞分化为肝细胞的过程中可能出现非目的细胞的混合细胞[13],降低了所得细胞的纯度,而成体干细胞来源的体外类器官模型则可以有效避免这一问题[9,14];诱导多能干细胞的基因组不稳定性也增加了其癌变的风险[15]。另外值得注意的是,人类胚胎干细胞的获取与利用具有潜在的伦理风险[16]。然而,肝脏成体干细胞的获取通常需要对患者进行肝脏穿刺或手术,而诱导多能干细胞所需要的体细胞的获取则要简便许多。另外,由于多能干细胞的状态更接近早期胚胎,多能干细胞向肝细胞分化也能为研究肝脏早期发育提供体外模型。
二、干细胞来源的肝细胞可模拟各类肝脏疾病
来源于患者的肝细胞可以有效模拟先天性肝病,例如Alagille综合征。Alagille综合征是一种多系统疾病,由Notch信号通路(包括Jagged1和NOTCH2)的杂合子突变引起,临床表现为胆管缺失和慢性胆囊炎。利用患者肝脏穿刺的样本,Huch[5]等建立了模拟Alagille综合征的三维肝脏类器官,该类器官的管腔中的胆管细胞大量凋亡,是Alagille综合征的典型特征。
成体干细胞及多能干细胞提供了几乎无限的肝细胞来源,使我们能够利用CRISPR/Cas9 技术对其进行基因编辑操作,通过制造或纠正特定突变能够帮助我们进一步研究肝脏先天性代谢性疾病的发病机制[17]。为了探索高饱和脂肪酸对饮食诱导的非酒精性脂肪肝的影响,Hendricks等[18]利用CRISPR技术生成了携带PNPLA3-I148M突变体的人胚肝类器官,用油酸和棕榈酸的浓缩混合物处理该类器官,最终发现FADS2可作为脂肪肝治疗的新潜在靶点。Warren等[19]利用多能干细胞分化而来的肝细胞进行全基因组关联研究,从而探究与肝病相关的等位基因变异。
使用肝病相关毒素处理干细胞来源的肝细胞还可在体外模拟由于环境因素所致肝病,并帮助我们进一步探究下游的反应机制[20-21]。Shinozawa等[20]设计了一种基于肝脏类器官的毒性筛选检测方法,用于分析 238 种上市药物(32种阴性对照和206种已报告的肝毒性药物)的肝毒性,结果表明该方法具有较高的预测价值,灵敏度88.7%,特异性88.9%,与原代肝细胞的评估结果相当。另外,Leite 等[22]还建立了肝细胞类器官模拟肝纤维化的体外模型,通过使用甲氨蝶呤等促纤维化化合物处理肝细胞类器官,并分析其细胞基因变化及类器官内胶原蛋白的积累情况,有助于体外研究。此外,用胺碘酮、舍曲林或阿米卡星处理成体肝脏干细胞衍生的肝脏类器官,可引起LAMP2和板层小体的表达增高,从而模拟由溶酶体中磷脂-药物复合物的形成所引起的磷脂贮积疾病的发生[23]。
干细胞分化而来的肝细胞还可在体外模拟感染性肝病。目前,诱发疟疾的疟原虫,埃博拉病毒,甲、乙、丙、丁和戊型肝炎病毒,均可通过干细胞来源的肝细胞建立体外的模型[17,24-26],除了体外感染原本不含乙型肝炎病毒(HBV)的肝脏类器官外,HBV感染者体内提取的肝细胞类器官也可用于模拟HBV对肝脏的影响,Fu等[7]验证了独立或联合使用恩替卡韦和Cas9/HBV-向导RNA(靶向HBV共价闭环DNA)可用于抑制乙型肝炎患者衍生的类器官中HBV复制的有效性。另外,SARS-CoV-2病毒也可能会影响肝脏等器官。Yang等[27]研究表明,表达血管紧张素转化酶2(ACE2,SARS-CoV-2的一种受体)的人多能干细胞衍生而来的肝细胞和胆管细胞类器官均能在体外模拟SARS-CoV-2病毒感染的过程。
综上,利用成体干细胞或多能干细胞分化使得我们可以在体外大规模地扩增肝细胞,解决了原代肝细胞难以获取及体外扩增的难题;利用成体干细胞或多能干细胞来源的肝细胞可以建立有效的体外肝病模型,为我们深入探究肝脏疾病的病理机制和开发治疗肝脏疾病的新型疗法提供了高效可转化的平台。
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