一、肝窦内皮细胞的生理结构

LSEC与血管内皮细胞相比最大的区别在于其存在窗孔和缺少基底膜,被认为是哺乳动物中渗透性最强的内皮细胞[4]。窗孔是直径为50～200nm的小孔,覆盖内皮表面的2%～20%[1]。窗孔组合形成称为“筛板”的簇,可根据不同的刺激而改变,决定LSEC的表型[6]。窗孔可动态改变其位置与直径,通过开合调控细胞内外的物质交换与信息传递。在肝窦一侧,LSEC暴露于血液中循环的物质,如丰富的营养物质、激素、胆汁酸和氧气[7]。

二、生理条件下肝窦内皮细胞的抗炎作用

(一)物理屏障功能 LSEC构成将血液与肝实质分开的物理屏障,高渗透性赋予其高度选择性,从而限制或允许循环白细胞进入肝组织[8]。在生理条件下,LSEC允许代谢产物、血浆蛋白、脂蛋白和乳糜微粒残留物通过,并被HC和HSC吸收,而包括红细胞、白细胞和血小板在内的血细胞则被限制在肝窦内[4]。

(二)维持肝窦微循环功能 在生理条件下,LSEC通过分泌血管活性物质,即一氧化氮(nitric oxide,NO)和内皮素-1(endothelin 1,ET-1)来调节血流[3]。NO促进血管扩张,ET-1则诱导血管收缩。胰岛素可触发AKT依赖的内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)磷酸化,从而介导内皮细胞NO的合成和释放。LSEC通过内皮特异性转录因子Kruppel样因子2(Kruppel-like factor 2,KLF-2)调节NO和ET-1的表达,维持正常的肝窦微循环功能[3]。LSEC来源的NO具有抑制肝脏炎症和胰岛素抵抗的生理作用,同时维持LSEC的正常形态,并限制KC和HSC的激活[9,10]。NO生物利用度降低引起以LSEC窗孔丧失和基底膜形成为特征的LSEC毛细血管化,并导致其分泌的血管活性物质失衡,从而促进NAFLD进展。肝窦内皮功能障碍的发生早于肝脏炎症或纤维化的发展,可作为NAFLD肝脏病理学发展的主要特征和早期事件[11]。

(三)调节淋巴细胞 在生理条件下,LSEC对淋巴细胞行为具有调节作用。LSEC在肝内发挥抗原呈递作用,同时LSEC本质具有抗炎特性,可防止肝脏免疫系统的过度激活[1]。同时,LSEC呈递抗原可诱导CD8+ T淋巴细胞耐受[7]。然而,与传统的抗原呈递细胞相比,LSEC并未诱导初始CD4+ T细胞向Th1表型分化,其引发的T淋巴细胞在再刺激时产生的负性免疫调节细胞因子(IL-4和IL-10)可能有助于肝脏免疫耐受微环境的形成[7]。LSEC诱导T淋巴细胞分化为具有免疫抑制功能的调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs),抑制效应T细胞增殖和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)产生,有助于控制肝脏和全身的炎症免疫反应[4]。

三、NAFL阶段肝窦内皮细胞发挥抗炎作用

NAFLD早期表现为NAFL,不伴有或仅伴有轻度炎症,LSEC作为NAFLD起始的第一道防线,发挥抗炎作用,防止肝脏免疫系统的过度激活,维持肝窦微环境稳态。

(一)下调趋化因子表达 有研究表明,在NAFLD发展的早期阶段,LSEC通过抑制白细胞募集到肝窦来发挥抗炎作用,这种效应是通过降低趋化因子CCL2、CXCL10和CXCL16的表达来介导的。当人类和小鼠LSEC短期暴露于游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)后,CXCL10和CXCL16表达减少可通过抑制单核细胞募集发挥抗炎作用[12]。使用MEK1/2抑制剂抑制MAPK信号传导时,趋化因子表达降低的作用受抑制,说明这种抗炎作用可能由MAPK信号传导的激活介导[12]。

(二)诱导IL-10表达 Neumann等[13]研究表明,在炎症条件下,LSEC表达的Notch配体DLL4在Th1细胞中激活Notch途径,诱导抗炎细胞因子IL-10的表达并激活抗炎反应。阻断体内IL-10信号传导可抑制LSEC刺激的Th1的免疫抑制活性。LSEC可通过调节共刺激因子表达以响应IL-10,抑制Th1和Th17细胞炎性细胞因子的分泌[14]。此外,IL-10可降低LSEC上MHC Ⅱ类分子的表达,还能降低LSEC甘露糖受体的活性[15]。IL-10通过下调LSEC呈递抗原的能力,导致LSEC特异性激活CD4+ T细胞克隆的能力下降。

(三)内吞作用 LSEC表达多种内吞受体,包括清道夫受体(scavenger receptor,SR)、甘露糖受体(mannose receptor,MR)和Fcγ受体Ⅱb2(FcγRⅡb2)。SR包括SR-A、SR-B和SR-H(stabilin-1和stabilin-2)[7]。LSEC和KC共同构成体内最大的清道夫细胞群,LSEC通过其活跃的内吞受体和高含量的溶酶体,有效地从血液中去除可溶性大分子和纳米颗粒,为维持血液和组织稳态做出重要贡献[16]。肝窦微循环功能障碍后,通过肝窦的血流量减少,使LSEC有足够的可能性清除血液中的废物大分子[16]。糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)是由还原糖与蛋白质、脂类和核酸等大分子的游离氨基发生非酶促反应,从而形成的一组稳定的终末产物。AGE可能作为“多重打击”学说中的一种“打击”因素参与了NAFLD的进展过程,其在各年龄段的NASH患者血清中水平升高[17]。低密度脂蛋白(low-density lipopro- tein,LDL)是血液中的主要胆固醇载体,可在动脉壁和血浆中进行体内氧化形成氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL),加速内皮功能障碍及动脉粥样硬化发展[1]。在发炎的肝窦中,LSEC管腔表面高度包被的透明质酸(hyaluronan,HA)与中性粒细胞表面的CD44相互作用,介导中性粒细胞的募集[7]。以stabilin为代表的SR可摄取并清除循环中的AGE、ox-LDL、HA等促炎性物质[16],MR还参与清除炎症反应中释放的溶酶体酶、组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)和髓过氧化物酶等分子,维持肝窦内组织稳态[18]。

(四)预防肠道菌群代谢产物引起的炎症 肝脏拥有独特的血液供应系统,是清除来自胃肠道和体循环血液中抗原物质的核心器官。相关研究已证实,肠道菌群失调与NAFLD之间存在显著关联[19]。肠道菌群衍生的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等致病性促炎分子由肠道进入血液循环后,LSEC可凭借其强大的内吞能力清除循环中大多数LPS,防止LPS全身性分布和广泛性炎症反应激活[4]。当LSEC长期暴露于LPS环境时,会对其促炎刺激产生耐受性,导致NF-κB核转位减少,从而减少白细胞与LSEC的黏附,改善肝窦微循环,表明LSEC可预防肠道微生物代谢产物引起的肝脏炎症[1]。

四、NASH阶段肝窦内皮细胞发挥促炎作用

随着NAFLD进展至NASH阶段,LSEC转而获得促炎表型,表现为促炎性细胞因子及趋化因子释放、黏附分子表达增加、血管生成增强[20]。

(一)释放细胞因子 LSEC可在NAFLD进展过程中释放包括细胞因子、趋化因子在内的促炎介质。Toll样受体(toll-like receptor,TLR)是一种跨膜蛋白家族,在不同的病原体识别和先天免疫反应的启动中发挥重要作用。TLR9是TLR家族的成员,介导CpG寡核苷酸的信号传导。相关研究已证明小鼠LSEC表达TLR9信使RNA和蛋白质,CpG首先通过SR介导的内吞作用被LSEC摄取,然后被递送至溶酶体定位的TLR9,导致转录因子NF-κB激活并分泌炎性细胞因子IL-1β和IL-6[1]。此外,LSEC可通过产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)来响应TLR1至TLR4、TLR6、TLR8和TLR9配体,通过产生IL-6来响应TLR3和TLR4配体,并通过产生IFN-β来响应TLR3配体[3]。以上研究结果说明,LSEC可通过产生多种细胞因子来响应各种类型的TLR 配体,LSEC对每种TLR配体的反应特征是独特的。

(二)释放趋化因子 趋化因子通过与G蛋白偶联受体结合并诱导整合素构象变化以促进高亲和力结合,从而有助于白细胞的牢固黏附[4]。Miyachi等[21]指出,LSEC可能是肝内CCL2(MCP-1)的重要来源。在NASH进展过程中,CCL2过度表达,促进骨髓来源表达CCR2的单核细胞在肝脏募集,进一步加剧胰岛素抵抗、脂肪组织炎症和肝脂肪变性[7,22]。CXCL9-11对于IFN-γ和TNF-α激活内皮细胞后T淋巴细胞的招募和迁移非常重要[4]。LSEC通过增加CXCL12的血管周围表达和激活CXCL12-CXCR4依赖性细胞内转运机制,增强NASH中CD4+ T淋巴细胞的募集[3]。随着NASH进展,脂肪变性、肝细胞气球样变、炎症、内皮功能障碍、纤维化等因素在LSEC产生异常的机械感觉和机械转导,诱导中性粒细胞趋化因子CXCL1的Notch依赖性分泌增加,募集中性粒细胞,形成中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET),促进炎症、微血管血栓形成、纤维化和门静脉高压的发生与发展[5,23,24]。

(三)黏附分子表达异常 LSEC可表达细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule 1,ICAM-1)和血管黏附蛋白(vascular adhesion protein 1,VAP-1)等黏附分子,使白细胞黏附于内皮细胞[1]。发生炎症期间,ICAM-1表达增加,并诱导血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)和CD31过量表达,导致白细胞跨内皮迁移[8]。与其他炎症组织的白细胞募集过程不同,由于肝窦狭窄的结构、低剪切应力环境和低水平表达的选择素作用有限,“滚动”并不是白细胞在肝脏微循环中募集的必要步骤[1]。以骨髓来源的巨噬细胞(bone-marrow-derived macrophages,BMM)和中性粒细胞为主的循环白细胞首先被活化的内皮细胞捕获,然后通过内皮细胞迁移进入肝实质,导致炎症灶的形成,从而加速疾病从NAFL向NASH进展[25]。此外,Patten等[26]观察到一种由ICAM-1和stabilin-1介导的淋巴细胞从一个LSEC内迁移到另一个LSEC内的“细胞内爬行”现象,可能有助于淋巴细胞在肝组织中的最佳定位。在炎症状态下,中性粒细胞也可上调黏附分子的表达并激活LSEC和KC,从而诱导包括BMM在内的白细胞的进一步募集。中性粒细胞过度激活并释放髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)可导致肝损伤,加剧炎症状态[3]。NASH患者血清可溶性VAP-1水平升高,VAP-1的基因缺失或药理学抑制可导致饮食诱导的NASH小鼠肝脏中白细胞募集减少[1]。针对VCAM-1配体ITG-α4、ITG-β1的中和抗体可抑制单核细胞的黏附和迁移,并改善饮食诱导小鼠的NASH[21,27]。

(四)促进血管生成 NASH小鼠和NASH患者中血管生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达均明显升高,同时炎症可促进血管生成的发生[7]。肝脏血管生成可促进NAFLD慢性炎症进展,抑制血管生成已被证明可改善肝脏炎症[1]。肝脏慢性炎症与血管生成共同形成了一个恶性循环。有研究指出,血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)可以通过激活Tie-2并阻断NF-κB发挥有效的抗炎作用,而Ang-2与Tie-2的竞争性结合可阻断Ang-1的抗炎功能并使内皮细胞对TNF-α信号敏感,从而促进炎症进展[28]。NASH患者血清Ang-2水平显著升高,LSEC是NASH肝脏Ang-2产生的主要来源[29]。Lefere等[29]研究表明,药物抑制Ang-2/Tie-2相互作用改善了MCD诱导的NASH小鼠的血管形态,并改善了NASH。随着NAFLD进展,LSEC特征性的窗孔消失,基底膜形成,导致氧扩散受损,缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)可诱导VEGF上调,同时刺激NF-κB信号通路[30]。伴随肝脏微血管炎症反应的激活,白细胞被机械性地困在狭窄的肝窦中或黏附在内皮上,进一步加剧了肝窦微循环障碍,缺氧刺激血管生成和炎症进展。新生成的血管本身可以通过表达趋化因子和黏附分子促进炎症细胞的募集促进炎症反应的持续,同时为炎症细胞提供氧气、营养物质以满足其高代谢需求,进一步加剧了炎症反应[30]。

(五)内皮功能障碍刺激KC激活 高脂喂养的NASH小鼠LSEC功能由抗炎转向促炎,黏附分子和趋化因子表达升高导致白细胞募集并浸润于肝实质中,炎症介质表达增加、NO水平降低及肝窦内皮功能障碍刺激KC激活[9]。激活的KC和募集的BMM产生的TNF-α、IL-1β等炎症介质可促进NASH进展并诱导胰岛素抵抗[31]。

(六)iNOS诱导氧化应激和促炎反应 在代谢综合征情况下,脂肪变性引起的胰岛素抵抗可通过eNOS的减少和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的增加导致内皮功能障碍[11]。以IFN-γ为代表的细胞因子和LPS可诱导LSEC中iNOS高表达[3,32]。NAFLD小鼠肝组织中iNOS的过度表达可诱导氧化应激和促炎反应,使用iNOS抑制剂SMT处理的CCL4诱导的肝纤维化小鼠肝脏TNF-α和COX-2表达降低[3,33]。

(七)自噬受损 LSEC自噬可调节NO生物利用度并维持LSEC稳态,在NAFLD动物模型和NAFLD患者的LSEC中均观察到自噬的缺陷[34,35]。LSEC自噬缺陷会增强趋化因子(CCL2、CCL5)、细胞因子(IL-6)和黏附分子(VCAM-1)的表达,促进肝脏炎症、内皮间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)和肝纤维化的发展[35]。靶向LSEC自噬可能成为一种有潜力的NASH治疗策略,关于LSEC自噬缺陷的机制仍需进一步研究。

(八)肝细胞来源的EV作用 细胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)可以在细胞之间运输其特定货物,从而在生理和病理条件下的细胞间通信中发挥重要作用[36]。脂毒性条件下的肝细胞释放促炎性EV,EV可被LSEC以Vanin-1(VNN1)依赖的方式有效摄取,并引发促血管生成信号,促进肝脏炎症[1]。富含ITG-α9、ITG-β1的EV可与LSEC VCAM-1结合并增强单核细胞与LSEC的黏附[27]。使用针对VCAM-1的中和抗体显著减少了单核细胞的肝脏浸润,改善了饮食诱导的小鼠NASH[27]。肝细胞来源的线粒体DNA通过EV到达窦间隙,与TLR9配体结合后,激活LSEC TLR9,导致炎性细胞因子上调[37]。除此之外,肝细胞还可释放富含趋化因子、神经酰胺等物质的EV,通过不同方式促进肝脏炎症[38,39]。

五、总结与展望

生理状态下,LSEC具有独特的窗孔结构,表现为促血管舒张、强内吞、抗炎、抗纤维化作用,担任维持肝脏稳态的重要角色。随着NAFLD进展,LSEC发生毛细血管化和肝窦内皮功能障碍,逐渐由抗炎转变为促炎表型,促进炎症、纤维化、血管生成的进展。因此,维持LSEC的抗炎表型或改善LSEC的促炎表型,可能是未来防治NAFLD及其并发症的有效策略。