摘要
目的建立并验证我国健康儿童血清维生素K参考区间。
方法横断面研究，根据我国东部、中部、西部、东北各区域0~14岁儿童人口分布比例，于2020年1月至2023年5月分层随机抽取807名0~14岁健康儿童作为研究对象，由12个省、自治区、直辖市16家医院完成样本收集。通过统一自制调查问卷收集儿童基本信息，采用液相色谱串联质谱法测定样本中血清维生素K 1、维生素K 2［四烯甲萘醌（MK-4）和甲萘醌-7（MK-7）］水平，直接法建立参考区间。按年龄分组，采用非参数检验Kruskal Wallis进行组间比较，采用非参数法确定参考区间（ P 2.5~ P 97.5）。另选取40名健康儿童（东部25名、中部10名、西部5名）进行小样本验证。
结果807名儿童年龄5.00（2.00，9.81）岁，男495名（61.3%）、女312名（38.7%）。纳入795名1月龄至14岁儿童建立参考区间，其中1月龄至3岁（303名）、4~14岁（492名），参考区间血清维生素K 1分别为0.09~4.54、0.10~1.73 μg/L，MK-7分别为0.07~1.42、0.19~2.03 μg/L。1月龄至14岁儿童MK-4参考区间为0~0.42 μg/L。验证样本血清维生素K 1、MK-4和MK-7测定值落在参考限外均未超过2个。
结论建立1月龄至14岁健康儿童维生素K 1、MK-4、MK-7参考区间并通过验证，可应用于评估儿童维生素K营养状况。
维生素K是人体重要的脂溶性维生素之一，天然形式包括维生素K 1和维生素K 2，维生素K 2主要为四烯甲萘醌（menaquinone-4，MK-4）和甲萘醌-7（menaquinone-7，MK-7）。维生素K是凝血因子合成过程中的辅酶，对于维持正常凝血功能具有重要作用 ［ 1 ］ 。因检验技术的限制，血液中维生素K水平及其与疾病的相关性仍缺乏临床数据。随着质谱检验技术的不断深入发展，维生素K的生理功能越来越多地被发现。维生素K不仅参与人体凝血功能，还在骨骼健康、心血管健康等方面发挥重要作用 ［ 2 , 3 ］ 。脂溶性维生素缺乏会造成人体生理功能异常，而过多的补充又可能因其在体内蓄积而产生危害。国内外临床对于维生素A、D、E的补充及其血清适宜水平的研究已经比较透彻，也均建立了正常参考区间，而对健康儿童血清维生素K水平的调查及参考区间方面的研究报道罕见。目前尚未建立维生素K的明确参考区间，但近年来十分重视对其研究，国外血清维生素K参考区间主要由第三方医学检验所如美国Mayo、德国MDI、日本FALCO等提供，由于各医学检验所的参考范围差异较大、缺乏一致性。建立准确、适用的维生素K参考区间既可为疾病诊断、疗效评价、预后判断及健康监测提供重要依据，为促进儿童健康成长提供数据支持，又可为相关研究提供借鉴和参考。本研究依据我国卫生行业标准WS/T402-2012“临床实验室检验项目参考区间的制定”以及美国临床实验室标准化协会（clinical and laboratory standard institute，CLSI）指南C28-A3推荐 ［ 4 , 5 ］ ，通过多中心协作，采用直接法建立健康儿童血清维生素K参考区间。
对象和方法
一、对象
横断面研究，于2020年1月至2023年5月分层随机抽取807名0~14岁健康体检儿童作为研究对象。由12个省、自治区、直辖市16家医院参与完成数据采集工作。按照2019年国家统计局官方网站公布我国东部、中部、西部、东北各区域0~14岁儿童人口比例抽取样本。东部区域为首都儿科研究所附属儿童医院、廊坊市广阳区妇幼保健院、南京医科大学附属儿童医院、山东第一医科大学第一附属医院（山东省千佛山医院）、厦门市湖里区妇幼保健院、广州市番禺区何贤纪念医院、深圳市龙华区妇幼保健院、北京大学深圳医院、广东省妇幼保健院；中部区域为河南省儿童医院、周口市妇幼保健院（周口市儿童医院）、安徽省儿童医院；西部区域为广西医科大学第二附属医院、重庆医科大学附属儿童医院、西安交通大学第一附属医院；东北区域为北京儿童医院黑龙江医院。按研究对象的纳入标准，从东部（25名）、中部（10名）、西部（5名）共选取40名健康儿童作为验证样本。本研究获得首都儿科研究所附属儿童医院伦理委员会批准（SHERLL2019038），家长均签署知情同意书。
纳入0~14岁健康体检儿童，既往健康，14 d内无急性呼吸道、消化道感染，同时满足以下条件：（1）体重、身高位于 P 3~ P 97 ［ 6 ］ ；（2）血常规和生化指标［白细胞、血红蛋白、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、尿素氮、总胆红素、直接胆红素（direct bilirubin，DBIL）］符合我国卫生行业标准WS/T 779-2021“儿童血细胞分析参考区间”和WS/T 780-2021“儿童临床常用生化检验项目参考区间”。排除早产儿。
二、方法
采用直接法建立健康儿童血清维生素K参考区间。
1. 样本量估算：根据参考区间建立标准WS/T402-2012及CLSI指南C28-A3的要求，每个分组内建立参考区间的样本量不少于120名，考虑到年龄至少分为5组，计算得到研究需要的最小样本量为600名。验证样本按照参考区间建立标准中小样本验证方法，每个参考区间需要最小样本量为20名。
2. 问卷调查：自制统一调查问卷，内容包括儿童年龄、性别、身高、体重、喂养情况，母亲文化程度、生育年龄、分娩孕周。
3. 体格测量：采用第8版《诸福棠实用儿科学》中体重、身高（长）的测量方法，选用符合国家质量标准（GB/T 7723-2017、GB/T 5704-2008）的不同精确度的婴儿秤或电子秤；3岁以下测量卧位身长，3岁及以上测量立位身高。体重测量结果精确至0.01 kg，身高（长）测量结果精确至0.1 cm。
4. 一般性检查：血常规和生化指标，包括白细胞、血红蛋白、ALT、尿素氮、总胆红素、DBIL。
5. 维生素K检测：按照卫生行业标准WS/T661-2020“静脉血液标本采集指南”要求于早晨空腹采集静脉血2 ml，4 ℃ 2 327× g离心10 min分离出血清，-20 ℃冷冻贮存运输至北京和合医学诊断技术股份有限公司中心实验室，采用液相色谱串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）检测血清维生素K 1、MK-4和MK-7水平。离心机为湖南湘仪实验室仪器开发有限公司湘仪台式低速离心机（L550）；检测仪器为日本岛津公司液相色谱三重四极杆质谱联用仪（LCMS-8050 CL）。
6. 分组：根据儿童年龄，分为1~3月龄、4~6月龄、7~11月龄、1~3岁、4~6岁、7~12岁、13~14岁组。
7. 质量控制：在研究正式开始前，由项目负责人对参与研究人员进行统一培训，统一调查方法和标准。各参与单位质量控制员负责现场及调查过程质量控制，问卷调查完成后，进行完整性、逻辑性校验，确保数据准确性和有效性，及时发现并纠正数据采集中的错误和偏差。血常规和生化指标的检测按照国家卫生健康委二级及以上单位的考核要求参加临床检验室间质量评价，保证检测结果的一致性。血清维生素K检测均交由北京和合医学诊断技术股份有限公司中心实验室完成，应用Westgard多规则质量控制方法来判定质量控制结果是否合格，所有质量控制CV值不得超出1/3TEa。
三、统计学分析
采用SPSS 21.0统计软件。应用Shapiro-Wilk检验判断数据是否服从正态分布。符合正态分布数据用 ± s
采用Dixon法进行离群值的剔除。呈非正态分布数据使用非参数法，以 P 2.5~ P 97.5确定参考区间。参考区间的验证使用卫生行业标准“临床实验室检验项目参考区间的制定”（WS/T402-2012）中的小样本验证方法，按照纳入排除标准收集每组20名符合要求的样本，将其测定值与需验证的参考区间比较，若落在参考限外的测定值不超过2个，则该参考区间可通过验证。
结果
讨论
参考文献（略）
