摘要坏死性小肠结肠炎（NEC）是新生儿期最常见的胃肠道急症，具有较高的发病率和病死率。单细胞测序技术是一项新兴的高通量测序技术，能够在单个细胞水平上对基因组、转录组、表观遗传组、蛋白组甚至多组学联合进行测序，以揭示细胞的异质性和功能差异。随着单细胞测序技术的广泛应用，其将改变人们对NEC肠道细胞生物学特征的理解，从而更准确地从分子层面阐述NEC发生和发展的机制，提高NEC的诊治水平，本文综述单细胞测序技术在探讨NEC发病机制以及诊治方面的应用进展。
新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一种严重的胃肠道疾病，多发生于早产儿，在极早产儿和极低出生体重儿中尤为常见，一旦发生，病死率可高达20%~30% ［ 1 ］ 。关于NEC发生的确切机制尚不明确，目前针对NEC患儿的保守治疗方式也十分有限，常常不得已行外科手术以切除病变肠管，但手术后幸存的NEC患儿还将伴随着各种短期及长期并发症，包括肠管粘连狭窄、短肠综合征、生长发育迟缓以及神经系统并发症等 ［ 2 , 3 ］ 。近年来，随着单细胞测序技术的发展，已能实现在单个细胞水平上探究基因表达信息，并评估NEC发生过程中复杂的细胞动力学，有望进一步认识该疾病的发病机制，并为临床提供新的治疗策略和预防方法。现对单细胞测序技术在NEC发病机制以及诊治方面的研究进展进行综述。
在单细胞测序技术出现之前，研究者们通常使用传统高通量测序技术分析NEC患儿肠道组织的转录组信息。Liu和Wang ［ 4 ］ 利用美国国立卫生研究院的高通量基因表达数据库中关于微小RNA（microRNA，miR）芯片的大规模荟萃分析显示，新生儿NEC中共有15个miR差异表达，其中miR-429、200a或b和miR-141或200c簇群表达较差，可能在新生儿NEC的发生发展过程中起着重要的作用。Ng等 ［ 5 ］ 研究发现，血浆miR-1290升高是一种潜在的生物标志物，可以区分NEC和新生儿脓毒血症，具有较高的灵敏度、特异度和预测价值。Wu等 ［ 6 ］ 研究发现NEC患儿小肠组织中miR-431与靶基因叉头盒蛋白（forkhead box protein，FOX）A1的表达，可以预测是选择手术治疗还是保守治疗，而miR-431-FOXA1轴可能在一定程度上增强了NEC的组织炎症反应，并参与促炎反应的病理生理过程。但传统高通量测序技术获得的是整个细胞群体的基因组信息，由于细胞异质性的存在，即使是相同来源的细胞，也可能携带差异明显的遗传信息，从而导致测序结果出现偏差。随着单细胞测序技术的发展和应用，传统高通量测序技术的缺陷得以弥补，详细探讨细胞异质性，发现并识别罕见的细胞亚型以及研究NEC中细胞间的相互作用逐渐成为可能。
单细胞测序技术是基于高通量测序方法，在单细胞分辨率下对DNA或RNA进行扩增和测序，获取并分析特定细胞类型的基因序列、转录组、蛋白质和表观遗传表达谱信息，以提供高分辨率的细胞间差异视图，主要包括单细胞转录组测序，单细胞DNA测序及单细胞DNA甲基组测序等 ［ 7 ］ 。相对于传统测序技术，单细胞测序技术在灵敏度、准确度和工作效率方面都得到了极大的提升，该技术可以分析复杂混合细胞中单个细胞的分子生物学信息，从而实现在单细胞水平上了解生物的不同状态和特征，不仅有助于深入了解细胞的异质性和功能差异，还可以通过揭示细胞在发育和疾病过程中的变化，探讨其发生发展的机制，同时还可以帮助发现和识别特定细胞亚群中的关键基因和信号通路，从而开发出新的靶向药物。目前已广泛应用于干细胞生物学、肿瘤生物学、发育生物学、免疫学和靶向药物发现 ［ 8 , 9 , 10 ］ 。
二、单细胞转录组测序技术应用于NEC发病机制的研究 目前认为NEC是由多种因素共同引起的，包括不成熟的肠道发育、肠道屏障功能障碍、肠道微生物群失调和过度的炎症反应。在NEC的发生过程中，肠道上皮细胞增殖减少、凋亡增加，免疫细胞群体大量启动并释放各种炎症细胞因子和信号传导分子，同时肠道间质细胞和内皮细胞也发生了相应的改变 ［ 11 , 12 ］ 。近年来随着单细胞测序技术在NEC研究中的应用，从而可以了解NEC中各类细胞群体的异质性及其相关的致病机制。
1. NEC与巨噬细胞：肠道巨噬细胞是肠道天然免疫的重要组成部分，由血单核细胞在肠道黏膜中募集和原位分化而成。既往研究表明在不同诱导因子的作用下，肠道巨噬细胞可分化为M1和M2不同的亚型，M1作为炎症的起始者，在受到脂多糖刺激时可以激活Toll样受体4（Toll-like receptor-4，TLR-4）并上调核因子（nuclear factor，NF）-κB信号传导，从而释放促炎细胞因子如白细胞介素（interleukin，IL）-1β和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等以形成炎症微环境，M2则上调IL-10、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β、胰岛素样生长因子（insulin like growth factor，IGF）和其他分子的表达，以发挥抗炎和组织修复的功能。根据分布位置和表面标志物等的不同，M1和M2还可以被进一步划分为不同亚群 ［ 13 , 14 ］ 。为了验证单细胞转录组测序是否可以从NEC肠道组织中检测出巨噬细胞的这种异质性，Olaloye等 ［ 15 ］ 对2例胎儿、2例新生儿以及2例NEC患儿的肠道组织进行了单细胞转录组测序分析，结果显示与胎儿和新生儿相比，NEC患儿中单核与巨噬细胞增加，并鉴定出特异性的CD16 +CD163 +单核与巨噬细胞，其呈现出炎性M1样特征，高度表达NF-κB、髓样细胞触发受体1、IL-1β、IL-1α以及钙卫蛋白（S100 A8和S100 A9）等，验证并进一步揭示了NEC中巨噬细胞的异质性特点。巨噬细胞具有强大的特性和作用，对NEC的发生既有保护也有促进的作用，利用单细胞测序技术，揭示NEC中巨噬细胞异质性，绘制相关免疫网络，将可能为NEC的治疗提供新策略。2. NEC与T细胞：淋巴细胞在NEC的发病或进展中的作用一直存在争议。近年来相关研究表明，辅助性T细胞（T help cell，Th）可能影响肠道炎症 ［ 16 ］ ，调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的减少以及Treg与Th17细胞比例的失衡可能参与NEC的发病机制 ［ 17 ］ 。Oshima等 ［ 18 ］ 使用单细胞转录组测序技术对NEC患儿T细胞亚群进行分析，结果显示Th1细胞与Th17细胞比例增加。同样地，Egozi等 ［ 19 ］ 的单细胞转录组测序图谱中显示Th17细胞典型表达的基因碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子（basic leucine zipper ATF-like transcription factor，BATF）和C-C基序趋化因子配体20（C-C motifchemokine ligand 20，CCL20）显著上调，与Treg身份或功能相关的基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（cytotoxic T lymphocyte associate antigen，CTLA）4、可诱导共刺激因子（inducible co-stimulator，ICOS）、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白（T cell immune receptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）、TNF受体超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）4以及IL-2受体α链（interleukin 2 receptor，alpha chain，IL2RA）下调，这些结果验证了NEC肠道T细胞的异质性特点。此外，Egozi等 ［ 19 ］ 还发现与对照相比，NEC中T细胞抗原受体（T-cell receptor，TCR）β链克隆性扩增，进一步搜索公共克隆数据库发现NEC中观察到的大多数顶级克隆与肠道巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）抗原结合的公共克隆具有相同的序列，但是这些克隆存在于所有NEC患儿和大多数健康胎儿的样本中，与CMV感染关系不大，但未来可以通过配对TCR的α链和β链分析进一步确定特异性克隆或抗原相互作用，以表征克隆扩增在NEC发病机制中的作用，这为进一步研究NEC的发生机制提供了新思路。Schreurs等 ［ 20 ］ 运用单细胞转录组测序比较婴儿和胎儿肠道组织CD4 +T细胞，发现胎儿肠道CD4 +T细胞中介导上皮细胞生长和细胞周期的基因表达上调。进一步比较NEC早产儿、无肠道炎症早产儿和足月儿的肠道CD4 +T细胞发现NEC患儿肠道中的TNF-α +CD4 +T细胞增多，并且与TNF诱导相关的基因TNF-α、B细胞抑制剂NF-κB光多肽基因增强剂、TNF-α诱导蛋白2和3表达增加，结合类器官共培养实验发现NEC患儿肠道内的TNF-α水平升高，导致肠道上皮细胞发育受损，肠道黏膜屏障功能障碍，表明TNF-α +CD4 +T细胞过度激活是NEC发生的诱因之一，提示TNF-α +CD4 +T细胞可作为NEC的预测靶标和治疗靶点。3. NEC与肠道上皮细胞：作为防止病原体微生物侵入机体的第一道防线，肠道上皮屏障在NEC中发挥着重要的作用。正常稳态条件下，上皮屏障由完整的隐窝-绒毛结构组成，隐窝底部的肠道干细胞不断自我更新，同时产生瞬时扩增细胞和祖细胞，然后分化为成熟的功能细胞类型。这些细胞类型相互合作，持续动态更新，为肠上皮提供了承受持续化学刺激和各种损伤的能力 ［ 21 ］ 。Egozi等 ［ 19 ］ 的单细胞转录组测序图谱显示与非NEC对照组相比，NEC中肠上皮细胞比例总体减少，绒毛顶部细胞减少，隐窝细胞增加，确定了不同上皮细胞表型在NEC肠道损伤中的改变。同时，NEC上皮细胞抗菌基因脂质运载蛋白2、再生胰岛衍生蛋白1α、再生胰岛衍生蛋白1β和恶性脑肿瘤缺失蛋白1显著增加，并表现出炎症表型，参与免疫细胞募集的C-X-C基序趋化因子配体（C-X-C motifchemokine ligand，CXCL）1、CXCL3、CXCL5和CXCL8上调，细胞通讯分析显示上皮细胞与免疫细胞之间的相互作用增加，表明NEC中肠上皮细胞与免疫细胞之间的通讯改变，炎性上皮细胞发育，从而进一步推动炎症的发生。4. NEC与成纤维细胞：成纤维细胞位于肠道固有层内，为上皮提供了支持基质。基质细胞与上皮细胞和免疫细胞动态相互作用，在调节上皮屏障稳态、肠道先天免疫、组织修复和肿瘤发展中发挥重要作用 ［ 22 , 23 ］ 。批量RNA测序研究表明在损伤或炎症时，所有成纤维细胞亚群都表达促炎基因，从而可能影响免疫细胞的募集和功能 ［ 24 , 25 ］ 。Egozi等 ［ 19 ］ 的单细胞转录组测序图谱显示NEC中成纤维细胞整体增加，表现出炎性基因IL-1β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocte-macrophage colony stimulating factor，CSF2）、粒细胞集落刺激因子（granulocte colony stimulating factor，CSF3）、生长因子和CCL20的增加并且与免疫细胞存在广泛的相互作用，从而验证了成纤维细胞在NEC发生中的作用。5. NEC与内皮细胞：研究认为肠道微循环功能障碍同样在NEC的整个发生过程中发挥着重要的作用。出生后血流动力学发生急剧变化，不成熟的调节控制会使肠系膜血管系统变得脆弱，尤其是在早产儿中。在各种因素的刺激下内皮细胞功能受损，肠道微循环功能障碍，进而可能发展为凝血坏死，导致NEC的发生 ［ 26 ］ 。Egozi等 ［ 19 ］ 的单细胞转录组测序图谱显示在NEC肠道组织中血管与淋巴内皮细胞的比例总体增加，并上调趋化因子（CCL2、CXCL1、CXCL2和CXCL3），趋向于促炎状态转变。此外，在血管内皮细胞中还观察到黏附分子、促凝因子以及收缩血管因子的上调，而灌注相关基因减少。通路分析显示，血管与淋巴内皮细胞均显著富集NF-κB应答基因、凋亡基因、趋化因子信号通路以及γ干扰素应答等。这些结果表明内皮细胞的过度炎症可能产生肠道微循环功能障碍，进而引起肠道炎症，导致NEC的发生。6. NEC与细胞间相互作用：在正常的肠道组织中，来自不同隔室的细胞相互作用以维持肠道屏障功能。如潘氏细胞、肠吸收细胞和固有层成纤维细胞共同维持上皮细胞更新，肠道巨噬细胞和T细胞共同维持免疫屏障 ［ 27 ］ 。而在NEC肠道组织中，这种相互作用的功能稳态被打乱和重塑。单细胞转录组测序图谱则可以描绘出NEC肠道中形成的细胞-细胞相互作用。Egozi等 ［ 19 ］ 的单细胞转录组测序图谱显示NEC肠道组织中血管内皮细胞与树突细胞的相互作用增加，成纤维细胞与上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞以及B细胞等细胞群的相互作用均增加。而Treg与巨噬细胞间的相互作用减少。配体-受体分析显示NEC血管内皮细胞通过上调整合素受体和细胞因子与白细胞进行信号传导，包括血管细胞黏附因子（vascular cell adhesion molecules，VCAM）1-整合素β1、IL-6、黏膜地址素细胞黏附因子（mucosaladdressin cell adhesion molecule，MAdCAM）1-整合素β7等。NEC淋巴内皮细胞主要通过细胞因子和趋化因子与白细胞相互作用，包括CCL3L1-CCR1、CXCL9或CXCL10或CXCL11-CXCR3及CCL20-CCR6等。NEC上皮细胞通过上调的TNFSF9水平与巨噬细胞相互作用，通过IL-1β-IL1R1或IL1R2和颗粒酶B（granzyme B，GZMB）-孕激素膜受体1（progesterone receptor mermbrane component 1，PGRMC1）与自然杀伤细胞进行信号传导。成纤维细胞通过CXCL10-SDC4和IL-15-IL2RA或IL15RA与巨噬细胞相互作用，并通过IL-1β-IL1R1和TNFSF14-TNFRSF14与Treg细胞相互作用。总的来说，细胞间配体-受体的增加可以改变肠道组织中上皮-间质-内皮-免疫相互作用，进而导致NEC的发生，这些潜在的相互作用，可能着代表NEC的未来治疗靶点。1. 细胞因子疗法：TNF是一种关键的促炎细胞因子，可以激活几乎任何细胞类型的炎症介质诱发炎症反应。Schreurs等 ［ 20 ］ 的单细胞转录组测序数据显示NEC患儿肠道中TNF-α +CD4 +Tem细胞显著增多，并且与TNF诱导相关的基因表达增加。Olaloye等 ［ 15 ］ 的单细胞转录组测序数据显示NEC患儿中单核与巨噬细胞比例增加，呈现出炎性M1样特征，显著富集与吞噬、活性氧产生以及细胞因子信号传导相关的基因，并且还上调许多内源性和外源性TLR激活途径。这些可能是因为早产儿易受大量脂多糖的影响，从而激活TLR-4并上调NF-κB信号传导，释放促炎细胞因子TNF-α，促进M1极化产生炎症反应，同时大剂量的TNF-α可以抑制肠道干细胞增殖，损伤肠道上皮组织。在NEC大鼠模型的肠道组织中，可以观察到TNF的升高，并且通过单克隆抗TNF抗体抑制TNF可以显著降低新生NEC大鼠的肠道炎症和组织损伤 ［ 28 ］ 。以上发现为临床上使用抗TNF-α治疗NEC提供了有利证明。
2. 蛋白质疗法：整合素是主要的细胞黏附跨膜受体，作为细胞外基质-细胞骨架连接体和转换器，在细胞与其环境之间的信号传递中发挥着重要的作用。整合素α4β7主要表达在淋巴细胞表面，可同时识别MAdCAM1和VCAM1两种配体。其中MAdCAM1主要表达在肠道，负责介导淋巴定向迁移至肠道组织；VCAM1主要表达在炎症部位的血管内皮表面、外周淋巴结以及骨髓。整合素α4β7复合物在活化淋巴细胞和先天免疫细胞中上调，可以导致白细胞外渗至肠道内皮小静脉，从而引起炎症反应 ［ 29 , 30 , 31 , 32 ］ 。Egozi等 ［ 19 ］ 的单细胞转录组测序图谱显示NEC肠道组织中涉及血管黏附分子VCAM1和MAdCAM1的配体-受体对升高，表明在NEC中整合素α4β7上调，引起血管内皮细胞的过度炎症反应，肠道微循环功能发生障碍，肠道组织缺血坏死，NEC发生。同时在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的研究中发现整合素α4β7上调是IBD的致病因素，阻断α4β7可以有效缓解IBD症状，整合素β7功能缺失可以抑制淋巴细胞向肠道部位的迁移和驻留，从而可以缓解T细胞诱导的肠炎的发病进程 ［ 33 , 34 , 35 ］ 。以上发现为使用整合素α4β7抑制剂改善NEC指引了新方向。
综上所述，单细胞测序技术是绘制NEC肠道细胞组成图谱和描述细胞异质性的理想选择，单细胞测序分析有助于表征细胞在NEC发生和发展过程中不同亚型和状态的转变轨迹，还有助于识别促进疾病的细胞亚群表型及其调控途径和细胞因子等，以获得更精确的靶向治疗和诊断标志。这一新兴的技术无疑将推动NEC研究领域到达一个新的高度，大大提高对NEC发病机制、早期诊断以及精准治疗的认识。目前关于NEC的单细胞转录组测序多集中于免疫细胞群体上，而对非免疫细胞群体的研究较少。未来的单细胞转录组测序研究可以涉及NEC肠道各类细胞亚群，分析其之间相互作用，探索细胞靶点和生物标志物为开发NEC新疗法提供新的见解。此外，单细胞转录组测序应该与其他组学技术相结合，从多个水平解释NEC发生发展机制，为NEC的诊治提供新线索。
参考文献（略）
1.哪种技术可以明确组织样本中某一类细胞的差异表达情况？()
A.整体组织RNA测序
B.单细胞RNA测序
C.蛋白质组学分析
D.微阵列分析
2.下面关于单细胞测序技术的描述中，哪项是错误的（）
A.可以用来分析细胞异质性
B.只适用于肿瘤生物学的研究
C.能够识别细胞亚群和寻找生物标志物
D.可以进行基因组、转录组和蛋白质组测序
3.NEC的主要危险因素为（）
A.肠道微生物群失调
B.肠道屏障功能障碍
C.过度炎症反应
D.以上3项
4.诊断NEC首选技术是（）
A.超声检查
B.X线成像
C.MRI扫描
D.CT扫描
5.美国学者 Olaloye利用单细胞转录组测序技术发现了NEC患儿中哪种免疫细胞的特异性亚型CD16 +CD163 +？( )
A.树突细胞
B.固有淋巴细胞
C.单核与巨噬细胞
D.T细胞
详情可点击下方链接查看
1.中华系列纸质期刊扫描答题
2.成为中华医学会杂志社读者俱乐部会员，参与答题
3.成为中华医学会杂志社期刊年卡会员，参与答题
