细菌感染是全球主要死亡原因之一，其中金黄色葡萄球菌是最常见的致命感染性细菌之一。该菌所致的感染主要依赖于一系列促进定植和侵袭的毒力因子，包括粘附因子、酶类和毒素等。其中，α-毒素作为外分泌毒素的代表，通过破坏靶细胞，在金黄色葡萄球菌抵抗宿主免疫、引发侵袭性感染以及在体内播散的过程中扮演着关键角色。
在感染过程中，宿主与病原体的代谢机制均会发生显著变化，以促进不同效应分子的产生。免疫细胞的代谢途径不仅决定了其炎症反应的状态，也影响了其清除病原体的能力。同样，金葡菌也会通过调整自身的代谢过程来增强感染力。感染期间，宿主细胞和金葡菌产生的乳酸含量均会显著上升。然而，尽管现有研究主要关注乳酸如何调节宿主的免疫反应，但对于这一金葡菌感染过程中的主要代谢产物，乳酸是否也会影响金葡菌毒力因子的表达或活化，目前尚不清楚。
近日，上海交通大学医学院附属仁济医院检验科李敏教授团队的一项最新研究发现金黄色葡萄球菌可通过增强重要成孔毒素——α-毒素的乳酸化修饰来促进其致病，并初步明确了金葡菌中调控乳酸化修饰的乳酰转移酶。这一发现不仅揭示了细菌蛋白质功能调控的新机制，也为抗细菌毒力策略提供了新的研究方向。文章发表在Nature Communications（IF：14.7）。
该研究发现感染或暴露于金黄色葡萄球菌培养滤液的A549肺泡上皮细胞会产生更高浓度的乳酸。随后，研究人员使用ST398菌株，通过测量细菌对红细胞的溶血活性来评估不同乳酸浓度下金黄色葡萄球菌的毒性。结果显示，乳酸的存在显著增强了金黄色葡萄球菌的溶血能力，而这一能力主要由α-毒素介导。
研究发现，乳酸增加的溶血活性并非因为Hla的转录或分泌蛋白水平变化，也非由乳酸引起的pH变化导致。为了进一步探究金黄色葡萄球菌中的蛋白质乳酸化现象，该研究使用一种特异抗体（Pan-αKla）检测乳酸化赖氨酸，发现金黄色葡萄球菌中的特定蛋白质发生了乳酸化，且这一现象在多个菌株中普遍存在。
通过LC-MS/MS技术，研究人员确认了金黄色葡萄球菌中蛋白质的非均匀乳酸化，特别是核糖体蛋白和溶血素/溶血素家族成员（如α-毒素、γ-毒素和LukAB）更易发生乳酸化。研究结果表明，α-毒素是乳酸化的主要靶点，并且乳酸化增强了其活性。
在探究金黄色葡萄球菌α-毒素的乳酸化对其细胞溶解能力的影响时，该研究确定了特定赖氨酸残基的乳酸化在调节α-毒素活性中起着关键作用。通过LC-MS/MS分析，研究人员确定了α-毒素中多个可能发生乳酸化的赖氨酸。为了确定哪个赖氨酸是乳酸化影响α-毒素溶血能力的关键，研究者们在α-毒素缺陷背景下表达了带有组氨酸标签的野生型α-毒素或赖氨酸到精氨酸突变体。
实验结果显示，仅有K84R突变体的表达显著降低了培养滤液对红细胞的细胞溶解能力。此外，构建的K84R基因组突变体也显示出降低的溶血能力，这一能力可以通过重新引入野生型α-毒素得到恢复。纯化的重组Hla K84R蛋白同样展现了降低的细胞溶解能力，且在乳酸剂量依赖性细胞溶解实验中无明显增加。这些结果均表明，在α-毒素中，K84的乳酸化对于其活性和毒性的调节至关重要。
随后，该研究探索了金黄色葡萄球菌中在α-毒素乳酸化介导的细胞溶解作用中关键酶。研究团队筛选了金黄色葡萄球菌ST398基因组中可能与赖氨酸乳酸化相关的基因，研究发现SAPIG0543、SAPIG1173和SAPIG2573这三个基因影响了其乳酸化过程。
进一步的体外乳酸化实验表明，这三个酶都能够使代表α毒素K84周围区域的肽中的赖氨酸乳酸化。特别是SAPIG1173和SAPIG2573的过表达，显著增加了培养液对红细胞和A549细胞的溶血和细胞溶解活性。相比之下，SAPIG0543对α-毒素的溶血活性影响较小。
为了进一步确认这些结果，研究人员构建了这三个基因的单基因敲除突变体，以及SAPIG1173和SAPIG2573的双基因敲除突变体和三基因敲除突变体。证实了SAPIG1173和SAPIG2573是主要负责乳酸化依赖的Hla介导的细胞溶解表型的乳酰转移酶，这种表型依赖于外部乳酸浓度。Hla K84R的溶血活性显著降低，进一步证实了K84R的特定作用。
最后，通过LC-MS/MS检测，证实了SAPIG1173和SAPIG2573酶对K84周围肽段的乳酸化活性。这些发现明确指出，SAPIG1173和SAPIG2573是α-毒素乳酸化导致细胞溶解活性增加的两种关键酶。
研究指出，α-毒素七聚体孔道中的K84残基位于帽区，可能不直接参与膜整合。α-毒素孔道形成的一个范畴是受体介导与非受体介导的α-毒素七聚体与目标膜的结合。前者主要依赖于去整合素和金属蛋白酶ADAM-10以及被认为在膜插入过程中为α-毒素部分形成锚点的caveolin-1。这一过程在低浓度下即可发生，而非受体依赖性孔道形成则受膜脂质组成影响，仅在α-毒素浓度较高（>1 μM）时发生。
在α-毒素七聚体孔道形成之前，包括单体与膜的结合、寡聚化形成与膜相关的七聚体前孔道、经历构象变化导致SDS稳定性增加，以及与膜整合相关的结构变化。虽然后者转变已被广泛研究，但α-毒素分子中单体与膜结合和寡聚化的结构先决条件尚不清楚。
该研究通过纯化的Hla和A549细胞裂解液进行的拉下实验，发现野生型与K84R α-毒素在拉下ADAM-10或caveolin-1的数量上没有差异，表明受体相互作用不受α-毒素分子中K84位点变化的影响。这些结果表明，α-毒素的乳酸化影响其与细胞膜的非受体依赖性结合。
通过小鼠的皮肤和肺部感染模型，该研究发现，与野生型金黄色葡萄球菌相比，乳酰转移酶基因敲除菌株（ΔSAPIG1173+SAPIG2573）在小鼠体内引起的脓肿尺寸更小，死亡率和细菌负荷更低，表明乳酸化影响了金黄色葡萄球菌的致病性。
感染改造菌株的小鼠在支气管肺泡灌洗液中的白细胞和炎症细胞因子水平较低，表明炎症反应减轻。组织学检查显示，感染野生型金黄色葡萄球菌的小鼠肺组织中有中性粒细胞浸润、肺泡萎陷和血管周围水肿，而感染改造菌株的小鼠这些症状几乎不存在。
随后使用α-毒素的K84R突变株和敲除了α-毒素基因的菌株来进行对照实验。结果表明，改造菌株的致病力缺陷主要是由α-毒素引起的，α-毒素的特异性乳酸化有助于增强金黄色葡萄球菌的体内致病力。
总之，该研究首次报道了乳酸化修饰介导的金葡菌毒力机制。并通过乳酸化修饰组学揭示了金葡菌通过乳酸化修饰调节其关键毒力因子α-毒素的活性，从而影响其在宿主体内的致病性。机制上，α-毒素K84位点的乳酸化和SAPIG1173及SAPIG2573基因编码的酰基转移酶对α-毒素的完全活性至关重要。研究揭示了乳酸化在细菌致病性中的重要作用，为未来的抗感染治疗提供了新的方向。
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医学博士，二级教授，博士生导师，上海交通大学医学院附属仁济医院检验科主任，教育部“长江学者”特聘教授，国家基金委优青，上海领军人才等。主要研究方向是临床重要病原菌流行致病与宿主互作。临床基础和转化研究成果先后发表Nat Med、Cell Host Microbe、Nat Microbiol等国际专业SCI期刊论著90多篇；曾主持国家自然基金11项；获得国家科学技术进步二等奖（第三完成人）。
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编辑：唐强虎 审校：方琪
