作者 | 梁家源
单位 | 广东药科大学东莞清溪医院（东莞市清溪医院）
人乳头状瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)是一种嗜上皮性的DNA病毒,目前已经发现200余种亚型,根据致癌性的不同将HPV分为高危型和低危型两大类[1]。
宫颈癌被认为是危害女性生命健康的第四大类恶性肿瘤，也是目前唯一病因明确且可预防的妇科恶性肿瘤，引起宫颈病变和造成宫颈癌致病的必要条件都需高危型HPV的持续感染[2]。
因此及时发现高危HPV的存在，对宫颈癌的预防与治疗非常重要。
近日，我们在工作中遇到一例中年妇女的高危型HPV检测结果在短时间内由阳转阴的案例，与大家一同探讨其消失之谜。
10月的一个夜班接到妇科医生的电话，告知有位患者的HPV基因分型(21型)结果与上周检查的HPV DNA(13种高危型)结果对不上。
查看患者资料：女性，42岁，工人，生活习惯良好，无吸烟史、无酗酒等，平日少运动，睡眠质量尚可；7月份于腰疼就诊本院，无其他妇科相关既往病史；
于10月1日因白带异常1月,伴有瘙痒不适就诊，要求行宫颈癌筛查检查，医生开了HPV DNA(13种高危型)检测和液基薄层细胞学检测(TCT)。
HPV DNA(13种高危型)检测：阳性；液基薄层细胞学检测(TCT)：未见上皮内病变或恶性病变(NILM)。见图1-2。
图1 HPV DNA(13种高危型)检测结果
图2 液基薄层细胞学检测(TCT)
患者于10月6日复诊，医生开单HPV基因分型(21型)进一步检测，其检测结果为基因分型全部阴性。在接到医生电话的当晚，请示上级后决定取消审核报告，并建议医生让患者重新取样复检。
次日同事将10月1日的HPV DNA(13种高危型)和10月6日HPV基因分型(21型)的标本从-20℃标本保存冰箱拿出，在相似的实验室条件下(温度26℃，湿度60%)放置半个小时溶解、处理及操作检测；
HPV DNA(13种高危型)在宏石SLAN-96P扩增；HPV DNA(13种高危型)在Bioer Life Express PCR仪扩增，在医用核酸分子快速杂交仪(HHM-2)杂交显色，结果与之前无异。
10月1日的HPV DNA(13种高危型)标本用A生物试剂检测，同批次检测的阴性对照Ct值: No Ct，临界阳性对照Ct值:31.68 (说明书要求HPV临界阳性对照30<Ct ≤36)，表示本批次检测质量可靠(见图3)。
图3 10月1日同批次HPV DNA(13种高危型)检测阴性对照和临界阳性对照扩增曲线图
患者HPV DNA(13种高危型)标本扩增曲线:循环数Ct值:35.05,扩增曲线为“S型”,符合阳性结果判读要求(见图4)。
图4 10月1日患者HPV DNA(13种高危型)扩增曲线图与试剂的结果判断解析
10月6日患者标本HPV基因分型(21型)B试剂扩增及杂交检测，杂交膜条显:Biotin(生物素）、IC(内标质控)出现蓝点表示试验结果有效，膜条其他基因型(空白格)未出现蓝点，患者结果为阴性。见图5。
图5 患者复检标本139号的HPV基因分型(21型)杂交膜条及结果判断图
10月30日，患者由原医生重采样并送检我科，在相近实验室环境下，使用同一批号B试剂盒，按照标准操作流程检测，重取标本HPV基因分型(21型)检测结果乃为阴性。
最后医生结合复检的结果，建议患者定期复查。见图6。
图6 HPV基因分型(21型)检测结果
HPV DNA(13种高危型)采用多重核酸扩增荧光技术的实时荧光PCR，以及HPV基因分型(21型)采用基因扩增技术和导流杂交原理的反向点杂交技术，其本质是核酸扩增技术，具有高灵敏度，高特异性的特点。
HPV DNA(13种高危型)检测采用A试剂盒，使用多重核酸扩增荧光检测法，根据13种高危型HPV的L1基因靶序列设计一组高特异的引物和探针，能在同一反应中检测宫颈口脱落细胞的13种高危型HPVDNA；
使用一种荧光信号(FAM)检测13种高危型HPV，不具体区分HPV型别；由于缺乏内源性人基因组DNA靶标作为对照，导致无法对标本是否取到细胞进行质控。
HPV基因分型(21型)检测采用B试剂盒，使用反向点杂交技术包括基因扩增技术和导流杂交原理两个程序；
通过反向点杂交检测扩增产物与包被有型特异性探针膜杂交结果,采用碱性磷酸酶系统定性检测,对21种HPV基因型进行分析检测;由于存在PCR扩增产物污染的风险,操作步骤较多和显色结果人为判读,易出现结果判断误差。
HPV基因分型(21型)的高危型HPV较HPV DNA(13种高危型)多检测HPV53、66两个基因型,且其最低检测限更低。见图7。
图7 HPV DNA(13种高危型)与HPV基因分型(21型)检测原理、基因型及灵敏度分析
冯琦慧等对1076例受试者的结果研究分析[3]，采用实时荧光定量PCR检测的C试剂盒检测14种高危型HPV(HPV16,18,其他不区分型)的HPV阳性率15.15%,采用反向点杂交技术的D HPV试剂盒检测15种高危型HPV(HPV全分型)的HPV阳性率17.94%;C试剂盒与D试剂盒检测的HPV分型检测的符合率95.72%,认为分型检测能力不存在差异。
由此可见,反向点杂交技术的灵敏度和特异性总体较实时荧光定量PCR检测良好,由此可认为采用反向点杂交技术检测患者的HPV基因分型(21型)结果为阴性并不是试剂本身的问题。
一、标本采集因素分析
查阅患者的就诊记录，发现初诊与复诊的妇科检查宫颈描述不一致(见图8),是否存在因取材效果不理想的缘故导致复诊的结果与初诊不一致,便把疑惑告知医生。
图8 患者初诊与复诊的妇科检查内容对比
医生告知轻度糜烂的本质是柱状上皮异位,常因为激素水平的变化导致宫颈的柱状上皮向外推移异位了,视为采取脱落细胞的重点部位。
医生进一步介绍,患者采样前准备都是按照要求:3天内停止阴道用药,采集前24H内禁止性生活及需月经干净后;三次采样均由同一妇科医生操作,其每次的取样操作方式和取样位置均保持一致。
医生与患者单独接触,采完样的标本管是由医生写名字直接交给患者,患者来我科打条码,核对条码的名字与管上的名字一致后贴在管上交给工作人员;实验室对标本的保存处理及检测严格按照操作要求。
初步排除了可能由于标本宫颈采样部位不同,导致未能取到含有HPV的脱落细胞;同时也排除患者拿错她人标本的可能,也进一步排除了科室同事检测过程的不规范及存在的差错。
二、HPV感染生理特性分析
HPV病毒是专性感染人表皮和粘膜鳞状上皮细胞,低危型HPV感染主要与肛门及外生殖器等部位黏膜的病变如生殖器尖锐湿疣、扁平疣等,较少引发恶性肿瘤;而高危型HPV感染是导致宫颈癌前病变及宫颈癌的主要因素。
往往宫颈癌的发病过程比较隐匿,初期常无明显的临床症状和体征,随着病情的发展及加重形成宫颈癌[5]。
HPV感染存在潜伏性、活动性两种不同的感染状态,潜伏性感染出现的不完整病毒颗粒,使患者的临床表现症状不明显或者不出现症状。
而活动性感染,HPV病毒感染宿主细胞并复制繁殖,性生活传染为主要方式,常导致患者出现一定的临床症状[6]。
在生理上,由于宫颈和阴道壁解剖结构的临近性,易存在交叉感染的情况,使宫颈和阴道壁的HPV感染情况接近;宫颈HPV持续存在不易完全清除情况的出现,也可能是阴道壁HPV持续阳性,即使宫颈HPV经治疗后转阴,可能会通过性接触还会使宫颈再次感染HPV[7]。
结合患者初诊的检查结果:无下腹痛,无阴道流血,无接触性出血,阴道通畅且内见少量白色分泌物,白带异常1月,伴有瘙痒不适等不明显临床表现的出现；
我们并不能通过主观的意识排除采样过程中,第一次采样时是否存在接触过阴道壁而导致HPV结果阳性的可能性。
对此不排除其处于潜伏性感染状态,即使本次复检基因分型阴性,结合患者为42周岁且临近围绝经期的高风险人群也应定期复查,排除存在感染的风险。
建议在筛查和治疗宫颈HPV病变的时候,考虑对阴道HPV给予筛查和治疗,以降低宫颈感染的风险。
一般来说HPV感染后,绝大多数机体可自主免疫清除,只有部分人群处于持续感染状态,继而发展为宫颈内上皮瘤样改变（CIN）,严重者发展为癌[8]。
宫颈癌的发生与高危型HPV持续感染有着紧密的关系,其HPV感染持续存在的时间常长达两年或两年以上。
高危型HPV病毒持续感染时,其病毒基因整合宿主DNA过程使其的E2断裂,导致E6和E7基因表达过度,细胞染色体的不稳定性增加,造成宿主细胞DNA过度表达[9];
加上HPV在体内以多种策略逃避人类免疫系统的识别和消除,远离免疫细胞的清除,其独特生命周期增生超过真皮,导致宫颈内上皮瘤样改变,最终形成宫颈癌[10]。
三、HPV 感染与年龄等因素关系分析
田凌君等对山西地区的研究[11],年龄与HPV感染率有关,年轻女性和年长女性感染率会出现两个峰值,与靳荣等对我国九大城市群的妇女高危HPV感染现状的统计[12]较为一致;
故可知我国女性HPV感染率按照年龄呈现“双峰”状分布,认为第一个高峰在“17～24岁”,第二个高峰在“40～44岁”[13]。
张蕴蕊等对广东部分地区14594名女性的HPV持续感染影响因素研究[14],持续感染的高危型HPV的女性人群年龄主要分布在31～50岁。一般认为低于30岁发生的感染更多是一过性感染,可以通过机体的免疫系统清除。
HPV的感染除了与年龄因素有关外,还与免疫因素、阴道微生态环境、围绝经期等有关。
女性性生活过频、过早、分娩过早等原因会让病毒有机会接触宫颈;其次年轻女性的宫颈发育相对不成熟,对病毒的抵抗力较弱;
杨彬冰等对南京地区健康体检女性的HPV感染现状分析发现[15],40～49岁年龄段女性感染率增高；
一方面由于无保护性接触的增加而感染,另一方面由于该年龄段女性处于围绝经期附近,卵巢功能开始衰退,雌激素水平降低,而出现生理和免疫功能紊乱,并出现情绪波动大、精神压力大、身体素质下降及身体锻炼减少等原因致使免疫力下降。
更需注意的是围绝经期女性由于生殖器官开始萎缩,生殖道黏膜变薄,对阴道致病菌的抵抗力降低,易造成细菌性阴道炎感染,从而使乳酸杆菌数量减少甚至消失。
由于阴道微环境发生改变,造成其内部的免疫微环境遭到破坏,导致乳酸杆菌抑制HPV感染的途径被阻断,对HPV的抑制及清除能力降低,导致病毒的感染时间增长[16]。
通常围绝经期女性HPV感染率的明显升高,多是既往HPV病毒复发的持续感染,并非感染新亚型病毒[17]。
另外HPV感染还可能与缺乏硒微量元素有关,硒具有抗氧化、协助清理自由基、提高机体免疫功能,加强机体对病毒的免疫清除能力,从而抑制肿瘤的发生和发展[18]。
四、HPV感染的转阴分析
目前有关HPV的转阴研究显示[19],在未处理的HPV感染人群中随着时间推移HPV转阴率增加,年轻人HPV感染后转阴会更快。
大多数免疫正常的人群生殖器感染仅为暂时性,持续1～2年。低危型HPV感染转阴时间常为5-12个月,高危型HPV感染转阴时间需更长为8-24个月。
其中生物钟节律关键因素(年龄、睡眠质量、焦虑状态)以及性生活频率、妊娠次数、工作状态等与HPV感染后转阴有关,其中睡眠质量对HPV感染后的转归具有重要作用,好的睡眠质量人群的转阴率是睡眠质量差人群的接近2倍[20]。
患者42岁临近围绝经期可能出现激素水平下降，工厂加班频繁加上身体锻炼减少;鉴于出现白带异常及瘙痒等症状,不排除由于临近围绝经期易发生阴道微环境变化及本身的免疫力的下降,使既往感染的HPV病毒复发。
建议在宫颈采取脱落细胞时,增加对阴道壁的采样,有望提高HPV的检出率,对患者的临床治疗给予一定的帮助。
即使一周时间内高危型HPV基因检查结果由阳变阴，尽管HPV病毒感染存在转阴的可能性,但是转阴不意味病毒的完全清除,也有可能是潜伏在人体,不能简单地认为患者不存在HPV感染,尤其是高危型HPV感染人群。
有研究发现[21],HPV感染人群中高危型HPV感染率更高达35.90%,整体单一型基因感染为主。尽管多重型感染率较低,但是HPV感染基因型越多,对黏膜的侵袭及损伤越大,持续感染时间也会延长,致癌风险也大大增加。
这也尽管高危型HPV可以自愈,但是多重型感染会增加致癌风险,危及生命,所以定期检查对于及时发现和处理可能的宫颈病变很有必要。
目前,HPV检测联合宫颈液基细胞学检查(TCT)是常用的宫颈癌早期筛查方式[22]。由于HPV+TCT联合检测对宫颈病变的阳性检出率远高于单独的HPV检测,临床上对于宫颈病变的阳性筛选价值更高[23]。
参考文献
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编辑：李玲 审校：陈雪礼
