总胆红素结果 -161.7 μmol/L，什么原因？

作者 | 陈婷

单位 | 张家界市人民医院

早在20世纪初，科学家就开始对人体的化学组成，如蛋白质、氨基酸和糖类等，以及体液相关成分含量的病理变化，进行了系列研究^[1]。由此可知，临床生化检验技术发展到目前已有一百多年的历史。

生化检验技术的发展由原始的人工配置试剂，加样，读取吸光度数值来计算结果到现在全自动生化分析仪器的全面使用，大大提高了工作效率，且试剂在厂家专业研发部门不断更新换代的情况下，检测系统抗干扰能力大幅提升。

常见的影响生化检验的干扰因素有：溶血（体内溶血与体外溶血），脂血，抗凝剂污染，输液同侧抽血，外源性药物如维生素C、游离甘油等，内源性干扰物质如类风湿因子、单克隆免疫球蛋白等^[2]。

由于临床生化检验技术的普遍应用，每一位在医疗机构奋战一线的检验人，特别是年轻一代检验人，需要晚夜班轮岗，都可能需要面临生化检验报告的审核。

于是能识别生化检验中的干扰，并使用应对措施解决干扰，发布准确的检验报告在生化检测中尤为重要。

本文将分享因探寻一标本总胆红素超低负值结果的原因而发现实际是华氏巨球蛋白血症的案例，分享如下：

2024年10月20日上午，在审核生化报告时，发现一报告单总胆红素结果为﹣161.7 μmol/L，在LIS系统报告旁有样本图片，扫一眼发现血清正常，于是立即查看总胆红素的反应曲线见下图一所示；并找出样本进行查看见下图二所示。

图1  总胆红素反应曲线 

图2  患者样本

查看后发现样本确实与LIS系统图片一致，并通过血清颜色，大致猜测该样本总胆红素是一个正常值，那么为什么结果提示是一个超低负值呢？

因为仪器结果是一个超低负值，所以仪器提示一个向上的三角形“▲”图标，意思是建议进行增量检测，于是将样本继续放入仪器自动进行增量检测，与此同时查看仪器的参数设置，见下图三所示；试剂说明书见下图四所示。

图3  总胆红素仪器参数设置 

图4  总胆红素试剂说明书

对照试剂说明书发现仪器的参数设置无误，仪器未设置减量模式，只设置了增量模式，且检测原理是样本在RI试剂（pH2.6）的环境中；

在表面活性剂的作用下，增进样本中未结合胆红素的溶解度，温育时间约5分钟，在加入R2试剂，样本中的总胆红素被钒酸盐氧化成胆绿素，胆红素的黄色逐渐消失，反应曲线在加入R2试剂后吸光度逐渐减弱，而本案例样本吸光度逐渐增强，于是结果是负值。

此时样本增量模式的结果已出，反应曲线如下图五所示：

图5  总胆红素增量模式反应曲线

查看此曲线，发现样本与R1试剂在混合后约第7点（换算约2分钟）后吸光度出现立即升高，在第13点（换算约4分钟）达到峰值后吸光度又逐渐下降，且结果提示＞Abs。

此时本人想到难道是样本中有干扰物质，与R1混合后吸光度增强导致？

于是立即找出同批检测的另外2份不同浓度的样本，与此样本一起进行仪器外的反应试验来一探究竟，并将样本进行1,2,3的编号，本案例样本为1号，2号样本总胆红素测定值13.4μmol/L，3号样本77.4μmol/L。样本状态如下图六所示，样本对应的浓度如下图七所示。

图6  1,2,3号样本状态

  图7  1,2,3号样本对应的浓度

仪器外试验采用试剂说明书中的试剂与样本配比进行反应，首先加入560μL的R1与20μL的样本进行混匀后放入37℃的温箱5分钟（因使用的生化样品杯，样品杯较短，故未接触到水浴箱中的水液面，建议使用玻璃试管进行），取出样品杯如下图八所示：

图8  样本与R1在37℃的温箱反应5分钟后

拍照保留图片后立即加入140μL的R2试剂，混匀，放入37℃的温箱继续孵育5分钟，然后取出样品杯，如下图九所示：

图9   加入R2试剂在37℃的温箱反应5分钟后

比较三个样品杯，发现1号样本杯变浑浊，与仪器反应曲线相呼应。2号样品杯与3号样品杯由浅黄或黄色变为无色，亦与总胆红素结果，仪器反应曲线相呼应。于是很确定样本中有干扰物质。

为了降低干扰物质的影响，最简单的方法是将样本进行稀释，查看试剂说明书，样本可进行6倍稀释，于是将500μL生理盐水与100μL样本进行混匀后测定。

同时查看患者病历，患者：汤某某，女性，80岁，因左侧胸部肋间及背部起红斑，水泡伴疼痛2天入我院皮肤科就诊，拟诊为“带状疱疹病毒感染”，既往偶有胸闷不适，未正规诊断与治疗；有间断腰痛，贴膏药后疼痛反复发作。

在皮肤科针对带状疱疹进行对应治疗，红斑较前变暗转淡，水泡较前明显干枯。继续回头查看患者总蛋白82.1g/L，白蛋白25.0g/L，计算的球蛋白57.1g/L。

此时笔者怀疑球蛋白增高与患者间断腰痛，与总胆红素超低负值有某种千丝万语的联系，于是在好奇心的驱使下，将样本进行了免疫全套测定。

过一会儿，使用生理盐水手动稀释6倍的结果与免疫全套结果均检测完成，样本用生理盐水稀释6倍的结果如下图十所示，免疫全套结果如下图十一所示：

图10  样本用生理盐水稀释6倍结果    

 图11  免疫全套结果

通过生理盐水手动稀释6倍的反应曲线可以看出，样本受到的干扰大大减少，结果手动乘以6是可靠的。

令人惊喜的是免疫全套结果IgM 60.4g/L，至此终于找出了总胆红素超低负值的谜团，于是立即审核生化报告，并备注，同时致电开医嘱的唐医生，建议进行免疫全套检测，并与血液内科进行会诊，初步猜测难道是华氏巨球蛋白血症？

于是生化报告如下图十二所示：

图12  最终发布的生化报告

与唐医生沟通后，立即开具了免疫全套的医嘱，收到条码后报告了免疫全套结果，如下图十三所示：

图13  发布的免疫全套的报告

10月21日唐医生邀请血液内科进行会诊，并与患者及家属沟通建议转科，同意后立即于21日上午转入血液内科进行进一步诊疗，转科记录如下图十四所示。

图14  转科记录

入住血液内科后，21日当天立即开具了血清蛋白免疫固定电泳，结果见下图十五；血清蛋白电泳，结果见下图十六；骨髓活检+特染1项+组化8项检查，结果见下图十七；白血病免疫分型15CD，结果见十八。

图15  血清蛋白免疫固定电泳 

图16  血清蛋白电泳

图17  骨髓活检 

图18  白血病免疫分型

血清免疫固定电泳提示IgM、κ泳道发现异常单克隆条带，单克隆免疫球蛋白类型为IgM-κ型。

血清蛋白电泳发现M蛋白条带，含量33.77g/L。

骨髓活检提示B淋巴细胞偶见小簇分布（占比约2%），浆细胞散在少数（占比约3%），考虑淋巴浆细胞淋巴瘤。

流式细胞分析可见约1.01%单克隆B淋巴细胞及约5.53%单克隆浆细胞。

综合上述结果，最终诊断为华氏巨球蛋白血症。总胆红素超低负值结果谜案终于告破！

每一个临床生化试验反应大致分为初始反应阶段与指示反应阶段（除一点终点法的试验以外），大部分生化试剂包括R1试剂与R2试剂；

其中R1试剂主要调节反应的酸碱环境、消除部分干扰因素（主要是消除外源性干扰因素）；R2试剂与准备好的样本进行反应，根据吸光度的变化采用合适的方法读取吸光度数值进行结果计算。

一般把R1试剂与样本进行混匀后在加入R2之前的反应阶段称为初始反应阶段，加入R2试剂以后的反应阶段称为指示反应阶段。

部分干扰因素若是出现在指示反应阶段，则通过查看反应曲线发现不了曲线的异常，比如生化检测中有部分检测的本质实际是抗原抗体反应；

例如采用免疫比浊法进行肌红蛋白浓度的检测，若样本中有嗜异性抗体的存在，那么嗜异性抗体冒充肌红蛋白与试剂微球包被的肌红蛋白抗体进行反应，在指示反应阶段曲线并不会有任何异常。

在例如巨酶的存在，亦会造成酶活性的假性升高，而反应曲线不会出现异常。此时需根据患者的其他生化结果如心肌酶谱等对结果做出分析判断。

而本案例中，样本中高浓度的κ型单克隆免疫球蛋白M与R1试剂混匀后，因R1试剂pH2.6，在强酸性环境中，M蛋白发生了变形，聚集，使反应中出现大量白色浑浊沉淀，而在初始反应阶段就已经干扰了检测，此种情况通过反应曲线则可发现异常。

对于常量模式检测（见下图十九）与增量模式检测（见下图二十）中曲线的变化，分析如下：

图19  常量模式反应曲线  

图20 增量模式反应曲线

根据仪器总胆红素参数设置可知，常量模式R1试剂112μL，样本4μL，R2试剂28μL；增量模式R1试剂112μL，样本10μL，R2试剂28μL；区别在于样本量分别是4μL与10μL。

在R1试剂PH为2.6的强酸性环境中，常量模式的4μL样本与增量模式的10μL样本中的单克隆免疫球蛋白M均出现J链或二硫键的断裂，使原本处于免疫球蛋白内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布相对减少，至使蛋白颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。

因常量模式中样本量加入的少，免疫球蛋白M出现化学键断裂后，相互碰撞的机会较少。

从常量模式反应曲线可以看出，从第1点到第14点处于蛋白的变性阶段，从第14点到38点均处于蛋白的聚集阶段。

从增量模式反应曲线可以看出，从第1点到第7点处于蛋白的变性阶段，从第7点到第13点处于蛋白的聚集阶段，从第13点到38点处于蛋白的沉淀阶段。

出现此现象的原因为增量模式样本加入量多，蛋白变性后相互碰撞的机会多，发生聚集与沉淀的速度更快。免疫球蛋白M是迄今为止发现的人体循环系统中最大的抗体，在分泌形态中由五个Y型单体排列而成五聚体。

五种球蛋白简易结构如下图二十一所示，免疫球蛋白G的详细结构如下图二十二所示：

图21  五种球蛋白简易结构

图22  免疫球蛋白G的详细结构

从结构图可发现免疫球蛋白M的分子量最大，五个单体通过二硫键，J链链接。

随着科学技术的进步，单克隆免疫球蛋白的干扰已得到有效的控制与解决，其中最简单的方法是稀释样本血清，通过稀释后样本血清的反应曲线判断稀释是否有效，其次使用去蛋白或使用蛋白稳定剂，或酸碱法去蛋白或优化反应条件。^[3]

后两种方法需要特别的化学试剂，并通过化学试剂的使用可能影响样本的继续检测，使用相对没有直接稀释方案便捷。在稀释方案解决不了的情况下，建议使用后两种方案。

本案例通过检出免疫全套发现免疫球蛋白M60.4g/L的结果后，临床主要需进行华氏巨球蛋白血症（WM）与多发性骨髓瘤（MM）的鉴别诊断。

当淋巴浆细胞淋巴瘤（LPL）侵犯骨髓同时伴有单克隆IgM血症时，则诊断为WM，大约90%-95%的LPL为WM，还有约10%的患者不分泌IgM，仅分泌单克隆IgA、IgG成分或不分泌单克隆免疫球蛋白，则诊断为非WM型LPL^[4]。

华氏巨球蛋白血症在血液中呈现大量单克隆巨球蛋白为特征的B淋巴细胞恶性病变，骨髓中典型表现以小淋巴细胞、伴有不同比例的浆细胞样淋巴细胞及成熟浆细胞增生为主，浆细胞样淋巴细胞异常增生是巨球蛋白血症最重要的骨髓形态特点；

免疫表型分析具有重要意义，主要表达CD10、CD19、CD20，不表达CD138；

血清蛋白电泳常在γ区出现M蛋白异常条带，免疫球蛋白定量IgM异常增高，多＞10g/L，免疫蛋白电泳确定为单克隆IgM型，κ轻链比λ轻链多见；不同于多发性骨髓瘤患者的是很少出现溶骨性病变、病理性骨折和肾功能减退。

多发型骨髓瘤骨髓内骨髓瘤细胞异常增生，涂片易见双核、三核、多核瘤细胞，可见瘤细胞簇聚集现象；免疫表型分析瘤细胞高比例表达CD38、CD138；

血清蛋白电泳出现异常M蛋白条带，最常见的是单克隆IgG型；病程进展缓慢，患者易出现贫血，感染，尤其神经系统症状或视力障碍等。通过骨髓细胞形态，骨髓细胞免疫表型，血清蛋白电泳可有效进行鉴别诊断^[5]。

本案例通过对总胆红素超低负值结果进行追根究底的查因，首先发现可能存在干扰，于是大胆探查并确定干扰物原来是免疫球蛋白M，立即与临床沟通，建议转科治疗，最后确诊为华氏巨球蛋白血症。

在此过程中，深刻理解了干扰对生化检验结果的影响，不同种类的干扰产生的不同反应曲线及应对干扰的解决方案；蛋白变性、聚集、沉淀的整个过程；温习了华氏巨球蛋白血症与多发性骨髓瘤的鉴别诊断。

点评专家：石喜   张家界市人民医院检验科  副主任技师

生化检验中干扰是普遍存在的现象，最常见的有脂血，溶血，黄疸等等。面对干扰时，我们不要谈干扰“色变”，而是识别干扰，有效解决，最终发出准确的报告尤为重要。

在日常检验工作中，发现特别异常的结果，能迅速分析并锁定原因，及时与临床沟通，并提出切实可行的有利于患者诊疗的方案能促进我们检验人员的工作经验得到很大的提升。

检验是临床的眼睛，通过日常工作中某些特别结果的分析，寻根究底可提高对患者疾病诊疗的全面与精准。

参考文献

[1]人民卫生出版社 全国高等学校教材供医学检验专业用 《临床生物化学检验》第一章绪论 第5版  主编 府伟灵 徐克前

[2]梁欢欢. 临床血液生化检验标本分析过程中影响检验结果准确性的因素 [J]中国医药指南2021年2月第19卷 第6期

[3]潘晓园、石慧、曹季军等. M蛋白干扰临床实验室检测项目的研究进展 [J]诊断学理论与实践 2023年第22卷第4期

[4]《淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症诊断与治疗中国指南（2022年版）》

[5]王中全、宋改芳、胡溢博. 华氏巨球蛋白血症实验室诊断与鉴别分析 [J]中国老年学杂志2013年8月第33卷