基因添加针对患者细胞内的缺陷基因，通过添加该基因的功能性副本来影响蛋白质表达，或通过插入不同的基因来绕过缺陷并恢复细胞功能。过去十年中已有数种疗法获得批准，并且各种递送载体方面的研究仍在持续进行。
基因添加是遗传代谢障碍疾病IEMS的未来治愈性疗法的一个类型，关于IEMS未来治愈性疗法可以关注此合集：遗传代谢障碍疾病的未来治愈性疗法
一、基因添加的原理
1、基因如何添加
基因添加工具使用称为载体的分子递送载体将功能基因（有时称为治疗基因或转基因）直接引入目标细胞的细胞核中。添加新基因时，通常使用体外或体内递送的病毒载体。载体是基因添加的重要组成部分。可以把这个载体想象成一个信封，用来把新基因运送到目的地。这个载体被称为载体。病毒载体是载体的一种。它被广泛使用，因为病毒天生就擅长进入细胞。为了制造载体，科学家取出病毒细胞，仅使用病毒的部分来灭活它。剩下的部分类似于病毒的轮廓，就像一个空信封，科学家可以重复使用来包装工作基因。
2、病毒载体递送
病毒因其进入细胞的效率而被用作载体，并且有几种不同类型的病毒载体用于基因添加。在将转基因带入患者细胞之前，需要对载体进行改造，以消除病毒致病基因及其复制能力。改良的病毒载体不含有致病基因。靶细胞在传递基因后会分解载体。
3、整合与非整合基因添加
一旦载体将转基因送入细胞核内（DNA 被包装在染色体中），细胞就会开始生成新的蛋白质来改善功能。然后，基因要么作为细胞中的额外 DNA 片段保留下来，要么插入染色体并整合到细胞自身的 DNA 中，这两种技术都会产生功能性蛋白质。
4、整合病毒载体
对于整合基因的添加，功能基因完全整合并成为宿主基因组的一部分，即使细胞分裂也能实现持续的蛋白质表达。
二、载体的类型
载体本质上是用于将治疗性遗传物质（例如工作基因）直接递送到细胞中的载体。载体通常来源于病毒，因为病毒已被证明能够非常有效地进入细胞。为了使载体使用安全，所有病毒基因都被去除，载体被修改为仅传递治疗基因。选择使用哪种病毒作为载体基于三个标准：
研究人员对病毒的了解程度如何
病毒对特定细胞类型的靶向能力如何
使用病毒有多安全
载体利用病毒外壳（也称为衣壳）将基因运送到靶细胞。载体就像用来传递特定信息的信封。信封允许传递信息，而信封内的信息则向细胞提供如何正常运作的新指令。使用病毒治疗疾病可能听起来有些落后，但载体的使用得到了多年研究的支持，并且已被证明是安全的，这始终是重中之重。
使用病毒载体的基因疗法不仅仅是治疗症状。载体携带的遗传信息可以直接针对疾病的病因并改变细胞的功能。此外，它们通常只需注射一次，通常用于治疗几乎没有其他治疗选择的罕见遗传疾病。
1、整合病毒载体
对于整合基因的添加，功能基因完全整合并成为宿主基因组的一部分，即使细胞分裂也能实现持续的蛋白质表达，常见的载体包括：逆转录病毒载体与慢病毒载体。
慢病毒和逆转录病毒载体可以携带更大的RNA基因包，然后将其转化为DNA。
慢病毒和逆转录病毒载体能够整合到细胞基因组中，因此最适合用于分裂细胞，而分裂细胞是离体治疗方法的目标。例如，这些载体用于靶向 T 细胞（一种免疫细胞）和干细胞（一种可以发育成多种细胞类型的特殊细胞）。与体内治疗不同，离体细胞治疗发生在体外。将细胞从体内取出，培养在培养皿中，使其复制和扩增。然后用载体处理这些细胞，并用新的遗传指令（例如工作基因）对其进行修改。然后将修改后的细胞返回体内。之后，经过处理的细胞开始分裂并产生新细胞。由于整合，新的遗传物质被复制到所有新细胞中，并继续在原始细胞之外发挥作用。
逆转录病毒载体
逆转录病毒的基因编码在 RNA 而非 DNA 中。它们在实验室生物学中被广泛使用且广为人知。由于它们能够实现持续的基因表达，因此它们可能是治疗多种单基因疾病的良好方法。免疫原性和插入诱变是这些载体更广泛临床应用的障碍。逆转录病毒由双链 RNA、逆转录酶和带有受体结合蛋白的脂质包膜组成。作为载体，它们能够传递大量的 RNA 遗传包，然后在整合之前转化为 DNA，并且经常用于离体方法。
慢病毒载体LVV
慢病毒载体可以将其基因组整合到体内分裂细胞和非分裂细胞中，从而实现稳定持久的新基因表达。慢病毒载体可以将遗传信息带入细胞核，从而有可能稳定持久地表达整合到细胞中的遗传信息，慢病毒是逆转录病毒的一个子类，具有相似的结构，包括由双链 RNA 和逆转录酶组成的遗传物质。 这些载体适用于体外治疗，能够携带大量物质进入目标细胞的基因组，并与非分裂细胞整合。
慢病毒是一种逆转录病毒，利用病毒逆转录酶和整合酶将病毒 DNA 插入宿主基因组。目前在基因治疗中研究的大多数慢病毒载体都是人类免疫缺陷病毒 1 (HIV-1) 衍生的载体。
慢病毒可以整合到宿主细胞基因组中。基因组整合可确保基因稳定表达；然而，它也可能通过激活致癌基因或破坏肿瘤抑制基因而增加插入突变的风险。
2、非整合病毒载体
对于非整合基因的添加，功能基因不会永久地整合到宿主基因组中，在非分裂细胞中提供稳定的表达，但在增殖细胞中的表达有限，常见的类型包括：腺相关病毒 (AAV) 载体与腺病毒载体（ADV）。
腺相关病毒 (AAV) 载体：
这些病毒是与细小病毒同属一类的小型单链 DNA 病毒。一种细小病毒会导致儿童出现皮疹，被称为“第五病”。然而，AAV 是另一种细小病毒，它们依赖于辅助病毒的共同感染来复制。难以复制的病毒使它们成为创建载体的更好候选者，AAV 载体是小型单链 DNA 病毒，依靠腺病毒进行复制，因此得名。这些载体可应用于体内方法，由于尺寸限制，通常传递小基因或 DNA 包。AVV是基因治疗中研究最多、使用最频繁的载体，目前涉及各种临床试验。AAV 有很多种类型。每种类型都有不同的特性，使它们能够针对不同的细胞，从肾细胞到大脑中的神经元。AAV不会引起疾病，而且如果没有辅助病毒的共同感染，就无法在靶细胞中复制。AAV的蛋白质外壳被重新用作包装，以保护功能基因并将其递送至目标细胞，从而治疗遗传疾病。
AAV 通常是非整合型的。这意味着它们携带的DNA通常不会插入细胞的基因组中。因此，如果载体被分裂的细胞吸收，治疗基因将不会在每次细胞分裂时复制，并且可能会随着时间的推移而丢失，从而削弱治疗效果。正因为如此，AAV 通常用于靶向非分裂细胞，例如肝脏、神经系统、眼睛和骨骼肌中的细胞。AAV 可以在患者体内存活很长一段时间，甚至可能是终生。
先天免疫是AAV的一个限制，因为许多人可能之前就通过自然感染接触过 AAV。这意味着，根据所使用的 AAV 类型，预先存在的抗体可能会使 30% 到 70% 的患者失去参加临床试验的资格。对于这些患者，他们的免疫系统可能会在载体提供治疗包之前攻击或摧毁载体，使其失效。此外，患者通常只能接受一次治疗，因为他们可能在第一次治疗后产生抗体。先天免疫测试正变得越来越普遍，并被用作临床试验资格的排除标准。目前，科学家正在研究各种策略来帮助应对这一挑战，例如制造不会被免疫系统攻击的合成衣壳，或利用一种可以在短期内分解抗体的酶。这些解决方案来自于了解载体被注射然后传播到目标细胞的时间窗口很短（数小时），并且一旦载体进入细胞内，它就会受到保护免受抗体的侵害。
腺病毒载体（ADV）：
腺病毒是一类常见病毒，可感染眼内膜、呼吸道和肺、肠道、泌尿道和神经系统。它们是发烧、咳嗽、喉咙痛、腹泻和红眼病的常见原因。腺病毒以双链DNA作为其遗传物质。与 AAV类似，例如，它们最常用于将DNA包递送到非分裂细胞中。然而，腺病毒载体更大，能够递送的基因包几乎是AAV的八倍。腺病毒载体可引起强烈的免疫反应，导致全身出现潜在的有害炎症并降低治疗效果。近年来，科学家一直致力于开发可引起较温和免疫反应的腺病毒载体，以便以更低的风险递送更大的基因包。
3、单纯疱疹病毒
可用于创建可携带大量遗传物质的载体，例如用于递送至神经细胞
4、慢病毒载体LVV与腺相关病毒AAV载体的区别：
除了源自两种不同的病毒外，LVV 和 AAV 之间的主要区别之一是它们的遗传物质的输送方式和输送位置。
LVV被视为整合载体：这意味着它们传递的遗传物质会永久整合到分裂和非分裂细胞的 DNA 中。即使细胞分裂，遗传物质也不会稀释，因为它会成为原始细胞 DNA 的一部分，以及源自原始细胞的每个新细胞。这意味着它是持久的，随着时间的推移，它能够继续提供与首次传递时相同的治疗效果。
AAV是非整合载体：当它们传递遗传物质时，治疗基因不会永久地整合到细胞的DNA中。由于缺乏整合，治疗效果会随着细胞每次分裂时剩余的遗传物质减少而减弱。在不分裂的细胞中，基因表达仍然持久。众所周知，AAV的免疫反应水平非常低。还有不同类型的 AAV 可以感染不同类型的细胞。正因为如此，AAV如今被广泛用于基因治疗，根据它们影响的器官和组织类型针对不同的疾病。
5、腺病毒载体ADV与腺相关病毒AAV载体的区别：
虽然AdV和AAV都是病毒载体，能够在传递遗传物质的过程中影响广泛的分裂细胞和非分裂细胞，但它们之间存在一些差异，主要是在包装能力、蛋白质表达水平、基因表达的开始/持续时间和免疫反应方面。AdV的容量比 AAV大。与AAV的低水平蛋白质表达相比，AdV还具有高水平的蛋白质和瞬时基因表达；然而，AAV具有持久基因表达的潜力。就表达开始而言，AdV可以在感染后约16-24 小时开始。AAV 需要的时间要长得多，最多需要 3-21 天。AAV的主要优点之一是它们触发免疫反应的水平非常低，而 AdV 通常会在靶细胞中触发高免疫反应。
6、其他限制
使用病毒载体的基因治疗具有很大的潜力，但并非没有风险。这些例子是上述局限性的补充，包括先天免疫和强烈的免疫反应。
脱靶效应是指给药后除主要靶组织以外的组织可能会受到影响。将其基因包插入宿主基因组的载体可能会整合到基因组的错误位置并导致意想不到的后果。为了尽可能多地控制这一过程，研究人员开发了靶向技术。此外，他们还能够在插入部位监测载体对患者的长期影响。
制造是该领域专业人士正在解决的另一个挑战。制造大量安全的病毒载体需要时间、精力和资源。该过程的复杂性增加了制造成本，并使得难以有效地简化生产。随着越来越多的基因疗法被研究和批准使用，研究人员将继续致力于更高效的生产方法。
7、非病毒载体
研究人员还在开发更多非病毒载体来解决（或消除）这些限制。非病毒载体的制造成本比病毒载体低。它们可以潜在地提供更大的基因包，允许重复给药，并使质量控制更容易。非病毒载体还具有降低引发不良免疫反应的可能性的优势。
尽管非病毒载体前景广阔，但科学家对它们的经验却很少。许多非病毒机制正在迅速发展，但挑战仍然存在，例如携带能力和针对特定器官或组织的能力。目前，它们不能用于AAV 和腺病毒载体常见的体内方法。
三、遗传代谢障碍疾病IEMS与基因疗法
1、遗传代谢障碍疾病IEMS
IEM疾病任何年龄均可发病，可以从胎儿期至老年期间发病，常以1岁为界分为早发型和晚发型，晚发型的患者一般酶活性比早发型的高，所以晚发型疾病程度也会比早发型的轻微，但是目前有些晚发型的患者预后没早发型的好，因为早发型的患者有些出生足跟血时候能筛查出来，或者早期急性期发作在专业的一线城市儿科代谢医生的诊断下确诊疾病，早期诊断进行疾病管理或者手术干预（肝移植）大部分能有正常的发育情况，而晚发型的患者出生时候因为代谢能力好，很多足跟血筛查没能查到异常代谢物，往往儿童晚期或者成年期急性期发作，在临床诊断方面又面临很多曲折，导致无法确诊，不能第一时间确诊，导致有些晚发型患者急性期发作很大可能会致残致死。
晚发型IEM疾病神经系统的临床表现具有高度的异质性，主要表现为癫痫、认知功能减退、精神行为异常、急/慢性脊髓病、运动障碍、周围神经病及肌肉病，而且这部分患者多在首次发病前生长发育正常，所以极易被误诊为后天获得性疾病，如脑炎、脊髓炎或其他变性病。
如果有的IEM疾病因不能及时诊断，以及进行错误的治疗，就会加重患者疾病进程，导致患者致残致死。例如将尿素循环障碍UCD患者，急性期昏迷、谵妄、癫痫、呕吐等症状当脑炎治疗，并进行皮质类固醇与大剂量丙球蛋白静脉注射等错误治疗方法，造成患者脑水肿脑损伤。
更多关于遗传代谢障碍疾病IEMS的介绍可以查看往期文章：遗传代谢障碍疾病IEMs的诊断方法：遗传代谢组学检测
2、IEMS疾病与基因疗法
IEMs的治疗目标是纠正代谢缺陷，主要治疗原则包括限制缺陷酶底物的摄入的饮食疗法、辅酶因子治疗、排氮剂促进毒性代谢产物排出、鸡尾酒疗法和肝移植疗法等。一大部分IEMs病种可防可控，若及早发现、正确干预，患者甚至可以无病健康生存。
遗传代谢障碍疾病（IEM）当下的治疗方法：
除了一部分类型IEM疾病可以肝移植根治，IEM的目前疗法都不是能治愈这类疾病的疗法，而且有的患者因为未能及时治疗出现脑损伤后遗症，因为脑损伤不可逆，就目前的疗法是不能治疗脑损伤的，未来疗法主要探讨的是治愈性疗法：基因疗法、酶替代疗法、干细胞疗法等，其中基因疗法与酶替代疗法可以根治患者这类代谢障碍疾病，干细胞疗法与脑机接口刺激可以修复人体神经（脑神经与肌肉神经等），这些未来疗法的配合治疗，可以将改变患者目前的医疗困境，此类疗法目前大部分在研发阶段，相信不久的将来会临床应用于患者治疗，现阶段患者需要管理好疾病与营养，等待医疗进步的那一天。
四、基因治疗的潜力、挑战和风险
1、潜在的
治疗致命疾病的希望：基因和细胞疗法可以帮助治疗治疗选择有限的疾病。如果不进行治疗，许多此类遗传性疾病将导致严重残疾或过早死亡。但早期研究表明，通过基因和细胞疗法，这些疾病的进展已经减缓或完全停止。
越早越好：如果在疾病发展过程中尽早接受基因治疗，就有可能在损害发生之前阻止它。目前仍在研究基因治疗在多大程度上可以逆转损害。
针对病因：基因和细胞疗法可以设计出针对人体数千个基因的治疗方法。
2、挑战
时间：在临床试验中测试潜在治疗方法并接受 FDA 批准程序是一个漫长的过程，通常需要很多年。诊断导致疾病症状的特定基因变异也可能需要时间。
没有放之四海而皆准的治疗方法：每种具有特定基因变异的疾病都需要特定的基因治疗方法。目前，大多数基因和细胞疗法仅限于治疗由单个基因变异引起的疾病。人们可能有不同的基因发生变化，但仍然患有相同的疾病。在这种情况下，他们可能需要针对其基因变异的不同基因治疗方法。目前正在努力开发平台和标准，以加快定制基因疗法的开发和交付。其中一个例子是定制基因治疗联盟，等等。
参与者人数少：基因疗法通常针对罕见疾病，这意味着患有这种疾病的人很少。这意味着收集有关潜在治疗方法的足够研究数据或找到足够多的符合临床试验资格的人可能需要更长的时间或更加困难。虽然每种疾病可能都很罕见，但罕见疾病加起来影响了约 4 亿人。有许多勤奋的患者权益组织和基金会致力于资助和推动这一领域的研究。
资金：准备临床试验、进行基因治疗以及确保试验以最高标准进行并确保参与者的安全需要花费高昂的成本。
需要准确性：基因和细胞疗法需要在正确的组织中以正确的水平在正确的时间内表达基因。这意味着需要进行大量研究以找到传递遗传物质的最佳方式。还需要考虑患者免疫系统对疗法的反应。
了解有关：临床试验过程的更多信息
3、风险
知情同意：在参加临床试验 之前，研究团队的成员应与参与者和/或护理人员一起审查任何潜在的风险和利益。重要的是，参与者了解他们在研究过程中的权利，并知道会发生什么。
不保证： 临床试验中研究的疗法不能保证治愈，也不能保证有益的结果。研究治疗总是有可能不起作用或可能产生意想不到的副作用。
重复给药：将异物输送到体内会引起免疫反应，并可能导致患者无法接受后续治疗。参加临床试验还可能使患者无法在未来参与其他试验或其他类型的治疗。这包括以后开发出更好的治疗方法。
长期影响未知：基因疗法可能会改变人的一生，因此人们应该意识到，目前尚不清楚基因疗法可能存在长期影响（无论是好是坏）。这就是为什么在治疗后要对患者进行多年的监测。
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遗传代谢诊断检测：血尿串联质谱、血气、乳酸、血氨、肝肾功能等
自闭症、脑瘫、癫痫、精神异常、抑郁症、智力障碍等神经异常疾病
END
