苏黎世联邦理工学院JACS：穆斯堡尔谱研究肌红蛋白通过阴离子金属酰胺中间体催化叠氮化物还原

文摘科学 2024-01-13 13:47 辽宁

近日，瑞士苏黎世联邦理工学院Donald Hilvert教授团队在“JACS”上报道了题为“Myoglobin-Catalyzed Azide Reduction Proceeds via an Anionic Metal Amide Intermediate”的最新研究成果。

研究内容

由血红素蛋白催化的亚硝基转移反应在碳氮键的立体选择性形成方面具有广泛的潜力。然而，生产亚硝基转移和不希望的亚硝基前体还原之间的竞争限制了这种生物催化方法的广泛实施。在这里，我们研究了模型血红素蛋白肌红蛋白对叠氮化物的还原，以获得控制关键反应中间体命运的因素的机制见解。在这个体系中，反应通过一种被提出的亚硝基中间体进行，该中间体被迅速还原和质子化，得到一种反应性的亚铁酰胺，我们通过UV/vis和Mössbauer光谱、量子力学计算和x射线晶体学对其进行了表征。亚铁酰胺的限速质子化反应生成相应的胺是催化循环的最后一步。这些发现有助于我们对血红素蛋白催化叠氮化物还原的理解，并为未来的酶工程运动提供指导，以创造更有效的亚硝基转移酶。此外，利用化学酶级联中的还原反应为取代吡咯提供了一条潜在的实用途径。

本文要点

要点1. 为了研究血红素依赖性叠氮化物还原，作者选择了氧储存蛋白肌红蛋白作为血红素系统的模型。作者合成了一组初级叠氮化物，它们是EDA的结构类似物(图1a)。将2-叠氮乙酸乙酯(Az-1)、1-叠氮丁酮-2- 1 (Az-2)和2-叠氮乙酰胺乙酯(Az-3)与Mb*在氮气气氛下孵育，均未发生反应。然而，在加入还原剂二亚硝酸钠后，观察到Az-1和Az-2的氮气立即演化，程度较轻。相比之下，在这些条件下，Az-3与酶没有明显的反应。在没有酶的情况下，用二亚砜处理叠氮化物时，没有观察到气体的析出。用核磁共振监测了这些反应。纯Az-1的核磁共振谱由化学位移为δ 4.1 ppm(两个氢)的四重态、3.9 ppm(两个氢)的单重态和1.1 ppm(三个氢)的三重态组成。

要点2. Mb*对Az-1和Az-2的还原可能遵循叠氮化物还原的一般机制：在第一步中，铁血红素辅因子被二亚铁酸盐还原，随后生成的亚铁血红素与叠氮化物反应生成亚硝基中间体，该中间体可以形成Fe(IV)、Fe(III)或Fe(II)。然后，必须将两个电子和两个质子转移到亚硝基上以生成胺并再生亚铁血红素催化剂。然而，既不知道电子和质子转移的确切顺序，也不知道中间体的电子性质。。

要点3. 用紫外/可见光谱法对Mb*与叠氮化物的反应进行了监测。正如预期的那样，在没有二硫代石的情况下，铁离子Mb*与Az-1或Az-2孵育1小时后，没有观察到光谱变化。在二硫代石的存在下，Mb*Fe(III)被还原为亚铁Mb*Fe(II)，在434 nm处有一个Soret带，在552 nm处有一个q带(图3，蓝色)。加入Az-2后，Soret峰变宽，在1 h内移动到425 nm左右。

要点4. 利用Mössbauer光谱法对Mb*Int和Mb*GlyOEt进行了进一步的表征，与其他光谱技术相比，该方法具有许多优点。与电子顺磁共振(EPR)光谱不同，它不局限于顺磁性化合物，因此报告了样品中存在的所有铁物种，允许氧化和自旋态的分配。Mössbauer光谱学因此非常适合探测Mb*Int的电子特性。由于Mössbauer对铁的光谱分析需要57Fe，我们制备了57Fe血红素，从Mb*中提取天然血红素辅因子，用57Fe血红素重组载脂蛋白，得到57Fe Mb*。在氩气条件下，将Az-1加入到还原的Mb*中，可以几乎定量地生成Mb*Int。该物种被鉴定为S = 0 Fe(II)物种，异构体位移δ = 0.38 mm S - 1，四极分裂|Δeq|= 0.89 mm S - 1。拟合过程产生了负值，但不能排除正值。由于高不对称参数η接近于1，因此很难明确确定四极分裂的标志。唯一检测到的其他物种(8%)是低自旋亚铁水合物Mb*(H2O)。为了确认Mb*Int和Mb*GlyOEt的S = 0态，并进一步研究两个物种之间的差异，在7 T时进行了场相关Mössbauer实验(图5b,d)。得到的Mb*Int光谱比Mb*GlyOEt的对应光谱更对称。光谱之间的明显差异包括在2 mm s-1左右的峰值，在Mb*GlyOEt中显着拓宽，以及在Mb*Int中没有的在0.5 mm s-1左右的Mb*GlyOEt中明显的特征。

小结

该工作捕获并表征了血红素蛋白催化叠氮化物还原为胺的活性阴离子铁中间体。从这项研究中获得的见解可能会启发预防这种通常不受欢迎的副反应的策略，并促进肌红蛋白变体的发展，这些变体能够催化其他具有挑战性的分子间亚硝基转移反应。

参考文献：

Matthias Tinzl, et al. Myoglobin-Catalyzed Azide Reduction Proceeds via an Anionic Metal Amide Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 2024, doi.org/10.1021/jacs.3c09279.

文章链接：

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.3c09279

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往期回顾：

●Science | 原位穆斯堡尔谱确定MOF活化氧产生的高自旋铁(IV)-氧位点

●Science | 同步辐射穆斯堡尔谱观测奇异金属的临界电荷模式

●纽约州立布法罗大学Nat. Catal. | 穆斯堡尔谱助力打破Fe-N-C氧还原燃料电池催化剂的活性-稳定性平衡

●美国威斯康星大学JACS | 穆斯堡尔谱定量Fe-N-C催化剂活性位点和化学动力学与分子探针方法的相关性

●美国德克萨斯大学Nat. Commun. | 穆斯堡尔谱研究血红蛋白催化的重氮酮环丙烷化反应机制

●日本九州大学JACS | 穆斯堡尔谱研究自旋交叉[FeCo]配合物中电子重排增强磁电性质

●美国加州理工学院Nat. Commun | 穆斯堡尔谱研究地核-地幔边界压力下FeO的熔化和缺陷转变