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近日，美国德克萨斯大学达拉斯分校Rudi Fasan教授、康乃尔大学Nozomi Ando教授、史蒂文斯理工学院Yong Zhang教授和牛津大学Michael L. Neidig教授团队在“Nat. Commun.”上报道了题为“Mechanistic manifold in a hemoprotein-catalyzed cyclopropanation reaction with diazoketone”的最新研究成果。
血红蛋白最近被认为是一种具有前景的生物催化剂，可应用于新型的自然碳转移反应。然而，我们对这些过程中生产性和非生产性途径之间相互作用的机制理解仍然有限。通过采用光谱、结构和计算方法，我们对肌红蛋白催化环丙化反应与重氮酮的机制进行了研究。这些研究揭示了该反应中关键催化步骤的性质和动力学，包括早期血红素结合重氮络合物中间体的形成，羰基形成速率的决定性质以及环丙烷化机制。我们的分析进一步揭示了该反应的复杂机制分歧的存在，其中包括导致血红素辅助因子的n键碳加合物形成的竞争途径，该途径被分离并通过x射线晶体学、UV-Vis和Mössbauer光谱进行了表征。这个物种可以再生活性生物催化剂，构成了一个非生产性但非破坏性的绕道，避免了主要催化循环的损耗。这些发现为血红蛋白催化的碳转移反应的机理分析和设计提供了一个有价值的框架。
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要点1. 环丙烷化反应的最佳反应条件（以TON为指标）包括使用亚铁Mb作为催化剂，通过蛋白质的铁形式通过原位还原产生，苯乙烯与BDK32的比例为4:1。在对该反应的研究中，我们观察到在没有苯乙烯底物的情况下，当蛋白质暴露于BDK试剂时，其颜色发生了一种特殊的变化，由特有的红色变为绿色（在此称为“Mb-cIII”种）。绿色出现后，持续数小时后会逐渐恢复为红色。在存在苯乙烯的情况下，未观察到颜色变化。通过紫外-可见吸收光谱测定，这种颜色变化对应于Soret波段从430 nm变化到427 nm，低强度Soret波段的变化（见图1b）。Q波段区域也受到影响，在530/560nm处吸光度降低，而在590nm处强度增加。
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要点2. 令人惊讶的是，Mb-cIII化合物的结构表征表明，该物种对应于一种蛋白质复合物，其中bdk衍生的碳烯部分转移到卟啉辅助因子的环氮原子上。由于这种修饰，血红素辅因子被扭曲，与平面血红素相比，吡咯环C在平面外的角度为约30°。一个通常位于血红素的远端的丙酸血红素基团显示双重占位，丙酸基团的另一个构象被转移到血红素的近端。Phe43及其邻近的残基看起来是无序的，可能是由于与插入化合物的苯基部分发生了空间冲突。此外，由于丙酸基团的易位，His97和血红素近端的邻近残基也出现紊乱。在我们的结构中，α-碳插入采用四面体的几何形状，表明碳原子在插入后质子化。此外，观察到Mb-cIII中α-碳原子与Fe中心之间的原子间距离为2.7 Å，远远大于Fe-N桥接血红素-碳络合物中C-Fe键长度（1.9 Å）28。尽管已经报道了与游离金属卟啉类似的n-烷基化血红素复合物33,34，并且从微粒体p450与卤化和烯烃化合物的反应中观察到n-烷基化卟啉加合物35,36,37，但据我们所知，在蛋白质背景下分离和结构阐明这种复合物是前所未有的。重要的是，通过晶体紫外-可见光谱测定的q带区域的匹配，我们确认了溶液中形成的绿色配合物与结晶蛋白复合物之间的对应关系。通过57Fe - 80K Mössbauer光谱进一步表征了Mb-cIII配合物和Mb-imi配合物。在这些实验中，使用二亚硫酸钠还原57Fe标记的Mb(H64G,V68A)，然后加入BDK，通过冷冻淬火捕获得到的物种分布。Mb-imi的Mössbauer光谱支持低自旋铁(II)物质的存在，其同分异构体位移(δ)为0.47 mm/s，四极分裂(|ΔEQ|)为1.00 mm/s。DFT计算（详见补充信息）表明，这些实验值与单重态(S = 0)形式的咪唑亚铁配合物最匹配（见补充表2）。相反，Mb-cIII的Mössbauer光谱显示，该物质对应于高自旋铁(II)，同分异构体位移(δ)为0.97 mm/s，四极分裂(|ΔEQ|)为4.00 mm/s。DFT计算用于预测通过晶体学观察到的Mb-cIII物种的Mössbauer参数，以及其他可能的复合物，如血红素结合的carbene24、26和Fe-N桥接的carbene28形式，类似于先前从其他血红蛋白与重氮酯之间的反应中分离出来的形式。通过晶体学观察发现，Mb-cIII配合物的五元(S = 2)形式与模拟Mössbauer参数最匹配。![]()
要点3. 虽然Mb和其他血红蛋白的环丙烷化反应被认为是由血红素-碳烯络合物介导的，但Mb-cIII络合物的分离和表征引发了关于其参与该反应催化循环的有趣问题。因此，研究人员提出了涉及该物种的不同机制方案，以指导进一步的实验（见图3）。第一种方案将Mb-cIII视为“死端”失活副产物，这与之前关于铁卟啉催化剂获得的相关配合物的报道一致33。两种可能的情况暗示Mb-cIII复合物是源自血红素-碳烯中间体（或其前体）的“非循环”中间体。在一种情况下，Mb-cIII复合物是一种不具备环丙化能力的物质，它能够再生血红素-碳烯复合物进行环丙化，即发挥类似于希尔弗特和同事最近报道的铁-n桥接血红素-碳烯复合物的作用28。在另一种情况下，Mb-cIII配合物通过Mb酶的再生重新进入催化循环（。尽管可能性较小，但我们也考虑了Mb-cIII配合物对环丙烷化具有催化能力，并代替或与血红素-二氧化碳中间体一起参与环丙烷化反应的情况。在这些工作假设的基础上，进行了实验来探讨这些不同的机制情景。![]()
要点4. 值得注意的是，在重氮化合物（即[苯乙烯]> 10 mM）上存在过量苯乙烯的实验中，模拟了应用于合成的优化条件，并且在这些条件下，环丙烷化反应以200 min^-1的初始周转频率（TOF）进行，并在2分钟内完成。由于Mb-cIII的形成时间（2-4分钟）比环丙烷化反应（< 1-2分钟）更长，因此这些结果不利于Mb-cIII作为催化物质参与环丙烷化反应的可能性。![]()
要点5. 虽然所有三种重氮-铁结合模式（C-， N-， O-结合）都是可获得的，但只有IntC1能产生与环丙烷化有关的IPC中间体。鉴于这些结果和IntC1→IntIPC的速率决定性质，如前所述，我们将早期中间Mb-ci分配给bdk结合形式的Mb蛋白。这一指派也与该中间体在苯乙烯存在的催化条件下的静息状态相一致。该工作在动力学、速率决定步骤以及关键中间体的光谱和电子特性方面获得了新的认识。揭示了反应机制的复杂性，阐明了生产和竞争反应途径之间的复杂相互作用，为在优化催化活性的启发式条件下提供基本原理。这些机制的了解还将促进新型和改进的碳转移酶的设计，推动在合成价值的非生物转化领域中扩大生物催化应用的努力。
Donggeon Nam, et al. Mechanistic manifold in a hemoprotein-catalyzed cyclopropanation reaction with diazoketone. Nat. Commun. 2023, 14, 7985 .
https://www.nature.com/articles/s41467-023-43559-7
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