自下而上的蛋白质组学常用于蛋白质鉴定和翻译后修饰 (PTM)位点的确定。这种方法通常将蛋白质消化成多肽，然后用电喷雾电离 (ESI)-串联质谱 (MS/MS)在正离子模式进行分析。尽管不太常见，但负离子模式分析可以提供互补的多肽鉴定和对酸性PTM（如磷酸化和硫酸化）更好的电离及稳定性。最常见的碰撞诱导解离（CID）可以产生高序列覆盖率，但通常会导致不稳定 PTM 的优先解离。电子捕获解离 (ECD)和电子转移解离 (ETD)可以保留PTM，但需要多电荷阳离子，这加剧了酸性 PTM 表征的难度。密歇根大学的Kristina Håkansson课题组近期在Analytical Chemistry上发表了题为“Negative-Ion Electron Capture Dissociation of MALDI-Generated Peptide Anions”的文章，将基质辅助激光解吸电离（MALDI）与负离子ECD（niECD）结合，实现了对具有和不具有 PTM 和其他化学修饰的各种肽的分析，且结果优于 ESI-niECD。
在niECD过程中，多肽阴离子捕获电子，从而产生电荷增加的自由基物种，这些物种从主链N-Cα键断裂中解离成主要保留PTM 的 c'/z• 型序列碎片。盐桥、两性离子的多肽阴离子结构（例如，对于整体单电荷阴离子，具有一个质子化位点和两个去质子化位点）可有效地进行 niECD，电子捕获发生在带正电荷的位点或附近。niECD对单电荷阴离子最有效，使用 ESI 很难在高丰度下产生这种低电荷状态，尤其是对于较大的多肽。MALDI主要生成单电荷离子，与传统ECD、ETD和EDD大多不兼容；在这里，作者证明MALDI-niECD不仅可行且其性能优于ESI-niECD。
图2 P1-P6的氨基酸序列及其c/z碎片离子强度总和
影响多肽气相两性离子结构的另一种策略是将碱性或酸性氨基酸残基化学衍生为更中性的位点，以降低两性离子倾向。水蛭素中唯一的碱性位点，即 N端胺基，被乙酰化并进行 MALDI-niECD。与相同条件下未衍生的水蛭素相比，仅部分碎片离子的碎片丰度产生变化。一种解释可能是N-乙酰化的N端或略带碱性的脯氨酸残基仍然允许两性离子结构。总体而言，MALDI生成的单电荷阴离子与ESI生成的阴离子具有相似的结构，并且盐桥结构在ESI-niECD和MALDI-niECD中都占优势。
虽然niECD可以碎裂多电荷阴离子，但这种MS/MS技术对单电荷阴离子最有效，因为阴离子和电子之间的库仑排斥力降低。由于MALDI优先产生单电荷分析物离子，即使在更高质量下也是如此，因此将niECD与MALDI结合的能力也使得能够对更大的多肽进行实验。单磷酸化的β-酪蛋白酶解肽段先前在ESI后以[M-2H]2-形式进行niECD。虽然观察到良好的序列覆盖率，但需要较长的气相反应时间（20 s）。MALDI-niECD 效率明显更高，可实现100%的序列覆盖率（5 s），几乎可以观察到所有可能的c’和z•型碎片离子，包括100%的磷酸化保留。
Pardaxin (m/z 3320)，胰岛素链 B（m/z 3495）的单电荷物种均可以在10 s的反应时间下得到接近100%的序列覆盖度。泛素 (m/z∼8600) 在较短的反应时间 (0.5 s) 更有效地产生∼m/z 4281的电荷增加物种，但没有观察到碎片离子，这可能是由于泛素的碱性和离子传输效率低导致前体离子信号低。
总结而言，MALDI通常生成单电荷离子，由于库仑排斥力降低，这些离子与niECD最兼容，高序列覆盖率最高可达m/z ∼3500，其性能优于ESI-niECD。
编辑：周柯汀
Kristina Håkansson
Professor of Chemistry, University of Michigan
Ph.D., Uppsala University, Sweden
Research interest:
The Håkansson group focuses on applying state-of-the-art mass spectrometric techniques to the following areas: 1) identification and characterization of protein posttranslational modifications; 2) mapping macromolecular contact surfaces; 3) exploration of the gas-phase fragmentation behavior of various biomolecules following ion-electron interactions; and 4) probing covalent intermediates in the catalysis of non-ribosomal peptide synthetases and polyketide synthases. A major goal is to excel in both analytical technique development and solving biologically relevant problems.
