近期，清华大学化学系瑕瑜课题组开发了一种在线二硫键-烯反应平台，通过在线调节反应溶剂的组成，在液相色谱分离后的二硫键肽段中实现最佳的部分还原效果，从而实现高覆盖率的二硫键鉴定。该项研究“High-coverage disulfide mapping enabled by programmable disulfide-ene reaction integrated onto a bottom-up protein analysis workflow”发表在Analytical Chemistry上。文章的第一作者为清华大学化学系2020级博士生周柯汀，通讯作者为瑕瑜教授。该研究得到了国家自然科学基金（No. 22074075）的支持。在药物开发和质量控制过程中，二硫键的鉴定对蛋白质药物的表征至关重要。传统的自下而上的蛋白质分析流程对二硫键进行完全还原，该方法无法分辨肽段中多个二硫键的连接方式。部分还原将含有多个二硫键的肽段还原为只含单个二硫键的肽段，通过质谱碎裂产生二硫键特征的碎片离子，可以实现二硫键全面鉴定。然而，多肽序列和二硫键的构型都会影响二硫键还原的速率，因此部分还原需要繁琐的反应条件优化步骤。此前，瑕瑜课题组已开发出一种快速可调节的二硫键还原烷基化方法。在254 nm紫外光照射下，丙酮/异丙醇的光引发自由基反应可将肽段中的二硫键还原为巯基，随后通过硫醇-烯反应进行烷基化。虽然降冰片烯在二硫键-烯反应中具有最快的反应速率，但其不溶于水，影响了在线反应时的产率。另一方面，此前部分还原是通过手动调节光照时间实现的，不具有灵活性。 图1 在线可调二硫键-烯烃反应工作流程对不同构型二硫键的适用性为了提高产率并增强修饰后多肽在质谱中的气相碎裂效率，作者测试了一系列烯烃的反应产率及其对多肽碎裂行为的影响。实验结果表明，5-降冰片烯-2,2-二甲醇不仅反应产率较高，还能促进多肽的气相碎裂，产生更多指示半胱氨酸残基位置的序列碎片。另一方面，丙酮的浓度对二硫键-烯反应的速率影响显著。因此，作者设计了通过调节反应溶剂中丙酮的百分比，实现二硫键-烯反应的在线调控，提供较高的灵活性，以实现不同程度的还原。为了探究二硫键构型对反应速率的影响，选取了含有6种二硫键构型的29个多肽作为模型，确定了实现部分还原的最佳反应条件（图1）。新建立的在线反应平台通过辅助泵向柱后流出液中注入光反应溶液，调节辅助泵的流速，从而改变流入光反应器中的丙酮浓度。实验结果表明，链内二硫键比链间二硫键更难还原，而在反相色谱中晚流出的二硫键多肽需要更高的丙酮浓度才能实现部分还原。
基于此，作者建立了针对多二硫键蛋白的分析流程（图2）。蛋白质在非还原条件下酶解产生的二硫键肽段首先在4%丙酮浓度下实现完全还原和烷基化，通过串联质谱分析实现序列鉴定。随后在建立的丙酮浓度梯度下实现二硫键肽段的在线部分还原，生成含单二硫键的肽段，并通过串联质谱分析鉴定二硫键的连接方式。该分析流程实现了对牛血清白蛋白全部17根二硫键的全面鉴定，并鉴定出人转铁蛋白19根二硫键中的16根。该分析流程还应用于碱性处理后的溶菌酶中，成功鉴定出13根错配生成的二硫键。为进一步验证该平台对复杂样品的分析能力，作者以人血清IgG为样品，鉴定了IgG恒定区的13根二硫键，并基于轻链亚型和重链亚类独有的二硫键肽段（图3），实现了对IgG kappa和lambda轻链（1.57：1）以及IgG 1-4亚类的相对定量，其中 IgG1为68.1±0.2%，IgG2为26.6±0.2%，IgG3为2.3±0.1%，IgG4为3.0±0.2%。
综上所述，本研究开发了一种可在线调控的二硫键-烯反应平台，并成功将其耦合到自下而上的蛋白质分析流程中，实现了全面的二硫键鉴定。该工作流程可进一步应用于蛋白质药物的质量控制，并为二硫键错配程度提供评估方法。
