尽管现代高分辨质谱（HRMS）仪器在分辨率、灵敏度和速度方面有了显著提升，但脂质组学分析仍面临一些挑战，比如脂质异构体的区域和立体异构体的鉴定。脂肪酰基链上碳-碳双键（C=C）的位置鉴定是现代脂质组学中的热点问题之一。鉴定不饱和脂肪酰基链上C=C位置的方法大致可分为三类，包括替代CID的碎裂技术、气相分子/离子反应和化学衍生化。
在本文中，首次使用3,6-双（甲氧羰基）-1,2,4,5-四嗪（BMCTz）进行逆电子需求Diels–Alder（IEDDA）反应，以确定脂肪酸（FA）和甘油磷脂（GP）中C=C键的位置。IEDDA反应是一种在富电子的亲双烯体和缺电子的四嗪（Tz）之间进行的生物正交点击反应，因其在体内对生物分子的时空控制、超分辨率成像以及揭示翻译后修饰的作用而受到关注。鉴于FA和GP中C═C键相对富电子的特性，选择了IEDDA反应。文中使用FA和GP标准品进行了测试和优化，最后研究了C=C位置在区分前列腺癌（PCa）和良性前列腺增生（BPH）患者血清样本中的作用。
作者首先验证了该反应用于鉴定FA的C=C位置的可行性。分别使用FA 18:1 n-9和FA 18:1 n-7与BMCTz在DCM中反应，负离子模式分析并使用NCE 20进行碎裂，图1显示了两个产物的二级谱图。两个双键位置异构体的碎片诊断离子分别是m/z 250.1685和m/z 222.1371。
在评估了Tz环加成法精确定位C=C双键的可行性后，使用FA 18:1 n-9对不同的反应条件进行了测试和比较。反应溶剂对衍生化效率具有较大影响。根据图2A，在四种反应溶剂中，DCM（二氯甲烷）和iPrOH（异丙醇）中产率最高，MeOH是二者一半左右，而MTBE（甲基叔丁基醚）会阻止反应发生。而对比反应时间在0.5-10min的跨度内，产物峰面积没有显著变化，甚至有随时间增加产率下降的趋势，作者解释可能是由于四嗪的副反应或氧化。碎裂能量对诊断离子的形成也有显著影响（图2C）。使用FA 18:1 n-9和n-7混合物针对对应诊断离子强度作图，也展现了良好的线性（R2=0.9963）和宽动态范围（从49:1到1:2）。
然而需注意的是，文中的IEDDA反应进一步用于甘油磷脂（GP）分析时，显示了一定的局限性。IEDDA反应产生的诊断离子主要依赖于负离子模式分析。在负离子模式下，GP如PE和PC才更易裂解生成脂肪酸链离子。而不同于在正离子模式下基于中性损失产生诊断离子的Paternò–Büchi反应。在负离子模式下，PE 16:0/18:1 n-9的脂肪酸离子（m/z 255.2332）进一步碎裂形成诊断离子（m/z 250.1685），并且诊断离子的相对丰度相比于FA低得多（图3）。此外，该方法也不适合Ether lipids的分析。
图3 PE 16:0/18:1 n-9的IEDDA反应前后二级谱图
最后，作者们对来自前列腺癌（PCa）和良性前列腺增生（BPH）患者的血清样本进行了脂质提取和IEDDA衍生化处理。鉴定到了多种脂肪酸和甘油磷脂的异构体，尤其是FA 18:1和FA 16:1的多种异构体。FA 18:1的主要异构体是n-9，其次是n-7和n-8。FA 18:1和FA 16:1的n-9/n-7比率在PCa和BPH样本中存在显著差异。
总之，这篇文章首次提出了一种基于点击逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）反应的新方法，用于鉴定脂肪酸和甘油磷脂中的碳-碳双键。通过对前列腺癌（PCa）和良性前列腺增生（BPH）患者血清样本的分析，揭示了两者之间脂质异构体的显著差异，特别是FA 18:1和FA 16:1的n-9/n-7比率。
编辑：陈永乐
审核：乔利鹏
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