脂质分子在生物膜蛋白的组装中发挥重要作用，然而，对于尺寸较大、具有蛋白质翻译后修饰的组装体来说，分析其中脂质分子的精细结构仍面临巨大挑战。近期，牛津大学Carol V. Robinson课题组在Nat. Protoc.期刊发表题为“Native MS-guided lipidomics to define endogenous lipid microenvironments of eukaryotic receptors and transporters”的文章。在这篇工作中，作者提出了Native MS（非变性质谱）与脂质组学相结合的方法，直接测定真核生物膜上蛋白组装体的内源性脂质信息，并可分析特定脂质分子与蛋白的亲和力。
蛋白质-脂质相互作用影响膜蛋白的构象与组装，进而调节膜蛋白的功能，而脂质在生物膜组成、与蛋白质特定位点结合等方式发挥着重要的调节作用。因此，鉴定膜蛋白的内源性脂质微环境，阐明脂质的调节作用具有很大的指导意义。目前，X-射线结晶及冷冻电镜方法可在原子层级水平描述蛋白质-脂质相互作用情况，但无法确定构象动力学复杂、异质性高的内源性脂质信息。2018年，作者课题组提出一种全面的MS分析策略，结合Native MS与脂质组学对原核生物膜上的蛋白质-脂质相互作用进行了直接分析。在本篇工作中，作者进一步完善了实验方案，具体描述了样品的纯化制备、平行的MS数据采集以及新的数据处理与分析步骤，覆盖了多种相互作用类型。此外，作者还讨论了脂质与组装体结合作用的关键因素以及对谱图质量不高、脂质分析不完善和实验结果不明确情况的原因分析。整体实验流程为：（1）利用Native MS分析膜蛋白组装体（2）鉴定膜蛋白组装体中共纯化的内源性脂质。
首先，作者以对转运体SPNS2的分析为例，介绍Native MS用于低丰度内源性脂质的分析策略。他们通过样品前处理去除原生的内源性脂质，再向膜蛋白复合物中加入特定的脂质分子直至Native MS的数据与天然复合物相匹配，通过脂质组学分析得内源性脂质为磷脂酰肌醇（PI），进而发现了多种低丰度的多磷酸PI与SPNS2的相互作用，并证实PIP2与SPNS2有最强的表观亲和力。
接着，作者以异质性高、具有N-糖基化修饰的LAT1-4F2hc复合物为例，介绍在谱图复杂、无法直接对脂质键连进行解卷积的情况下如何进行分析。4F2hc亚基上具有4个N-糖基化位点，结合糖蛋白组学、Native MS分析和脂质组学，作者发现添加2个Gal-GlcNAc和1个Neu5Ac-Gal-(Fuc)GlcNAc单元可与预测的磷脂峰重叠，进而获得无N-糖基化修饰的LAT1-4F2hc突变体以减少重叠。同时，作者通过还原两个亚基之间的二硫键以释放LAT1亚基，从而直接测定脂质与LAT1亚基之间的键合信息，即内源性脂质PE参与了复合物的组装。
然后，作者又分别以对GPR158受体、V-type ATPase、G蛋白偶联受体rhodopsin的分析为例，分别提出了在降低复合物复杂性后仍难解析脂质键合信息、在多亚基膜蛋白组装体内存在其他脂质干扰、揭示膜蛋白组装体内功能脂质三类情况下的蛋白质-脂质相互作用分析策略，为真核生物膜上受体、转运体内脂质微环境的解析提供了可靠方法。
综合来看，作者提出的基于Native MS的脂质组学策略能够覆盖到磷脂、甘油酯、糖脂等多类脂质与蛋白质相互作用的分析中，可鉴定真核生物膜上蛋白复合物的内源性脂质微环境。但此方法目前只适用于纯化的膜蛋白复合物，对于实时的、不稳定的蛋白质-脂质相互作用仍无法准确探测。
编辑：周未申
审核：乔利鹏
作者信息
Carol V. Robinson
Dr Lee's Professor of Chemistry
Director of the Kavli Institute for Nanoscience Discovery at Oxford
Research interest:
1.Recapitulating physiological environments using novel detergents and membrane mimetics
2.Ejecting complexes directly from membranes
3.Uncovering mechanisms of drug resistance
4.Linking post-translational modifications to function of protein complexes
5.Trapping metabolites in membrane proteins to link protein complexes to health disorders
