Anal. Chem. | Middle-Down质谱法结合质子转移电荷减少技术增强ADC中的载荷定位
学术
2024-11-14 16:33
北京
抗体-药物偶联物（ADC）是一种创新的免疫疗法，它们通过结合抗体的靶向特异性和细胞毒性药物的高效性，来实现对恶性细胞的精确打击。ADC的构造包括一个抗体部分和一个或多个通过共价键与抗体连接的小分子药物（有效载荷），这些连接通常发生在赖氨酸或半胱氨酸残基上。偶联过程可能会产生一系列药物-抗体比率（DAR）不同的ADC。为了全面评估产品的质量，必须确定几个关键质量属性（CQAs），包括抗体的结构、大小和电荷变异、裸露抗体和未修饰连接子的数量、DAR和药物负载分布，以及结合位点等。Middle-down质谱法主要在亚单元水平（约25 kDa）进行分析，在串联质谱（MS2）中，碎片离子信号在约25 kDa的亚基中存在严重的重叠现象，这阻碍了对载荷修饰的氨基酸位点诊断离子的识别。质子转移电荷减少（PTCR）技术通过使用单电荷阴离子对多电荷阳离子进行去质子化，最终将电荷减少的阳离子分布到一个很宽的m/z范围内。应用PTCR后，可以在原本峰重叠而无法分辨的谱图中获得可分辨的同位素峰簇。俄克拉荷马大学的Luca Fornelli课题组，在Analytical Chemistry上发表了一篇题为“Enhanced Payload Localization in Antibody−Drug Conjugates Using a Middle-Down Mass Spectrometry Approach with Proton Transfer Charge Reduction”的文章，将middle-down质谱法与PTCR-MS3技术结合使用，成功地在ADC模拟物的亚单元异构体中实现了所有载荷的精确定位，并揭示了位置异构体之间的载荷修饰位点差异。作者使用了一种非毒性的ADC模拟物作为分析对象，它结合了IgG1骨架和通过半胱氨酸链接的荧光团。偶联策略依赖于抗体的部分还原，使得两条重链（Hc）之间以及轻-重链(Lc-Hc)之间的链间二硫键断裂，并将载荷修饰到释放的巯基上。 在IdeS酶解和还原ADC模拟物后，通过LC-MS1确认酶解产物，并确定后续的MS2和PTCR MS3分析目标。色谱图中共出现9个不同的峰，其化学组成可以通过高分辨率完整质量分析推断，按照洗脱顺序，这些峰对应于Fc/2（糖构型为G0F和G1F）、带有0和1个载荷的Lc，以及带有0−3个载荷的各种Fd′亚单元。Lc亚单位上，药物分子的附着只能发生在一个特定位置（C217，C末端）；来自Hc的Fd′亚单位，包括三个潜在的偶联位点：C224，C230和C233，这些偶联位点的鉴定需要足够高的的序列覆盖度，特别是在C末端区域，以允许产生显示存在或不存在载荷的诊断离子。研究中使用了四种碎裂技术进行串联质谱分析，其中高能碰撞解离（HCD）产生了最低的序列覆盖度；其次是紫外光解离（UVPD），虽然产生了多样化的片段离子，但观察到的片段离子通常信噪比低，使得手动验证变得复杂；电子转移解离（ETD）的混合模式（EThcD）实现了最高的序列覆盖度，超过了常规的ETD，对于大多数Fd′修饰异构体，EThcD能够准确定位其修饰位点信息。在MS2实验中，多电荷碎片离子主要聚集在800−1400 m/z范围内，其中离子信号重叠是不可避免的，应用PTCR后，去质子化的碎片离子分散在500−8000 m/z范围中。通过EThcD MS2获得的带有0到3个载荷的Fd′异构体的序列覆盖率在51%到55%之间，在去质子化后，序列覆盖率增加到71%−82%。 在四种碎裂技术中，仅有EThcD MS2−PTCR MS3实验实现了所有亚单元异构体的完全表征。当将所有MS2与PTCR MS3结合的结果合并时，亚单元的序列覆盖率通常超过85%，携带载荷的Lc+1和Fd′+3达到了超过90%的组合序列覆盖率。综上所述，这项工作展示了PTCR在ADC的middle-down质谱分析中用于谱图去重叠的效用，实现了所有修饰位点的明确定位，这是此前使用middle-down方法分析ADC从未实现的。该方法的另一个突出特点是，这样的结果可以在单次LC-MS3实验中使用EThcD和PTCR实现。该方法有望应用于其他具有更高异质性的生物治疗药物的表征，如通过赖氨酸修饰的ADC。 审核：乔利鹏
Assistant Professor of Biology，University of OklahomaHis research focuses on the study of the proteins present in an organism, or proteomics, using high resolution mass spectrometry. His group uses top-down proteomics to study the specific modification patterns of proteoforms differentially localized in various sub-cellular compartments, or how different proteoforms derived from the same gene can distinguish between healthy and aberrant phenotypes.
