近期，阿尔伯塔大学John Klassen课题组在J. Am. Chem. Soc上发表了题为“Elusive Protein−Glycosphingolipid Interactions Revealed by Membrane Anchor-Assisted Native Mass Spectrometry”的文章，他们开发了一种膜锚辅助天然质谱(MEmbrane ANchor-assisted nMS, MEAN-nMS)和捕获释放策略(catch-and-release, CaR)相结合的方法(MEAN-CaR-nMS)，实现了直接从细胞中检测鞘糖脂(glycosphingolipids, GSLs)配体。
GSLs和聚糖结合蛋白(glycan-binding proteins, GBPs)之间的相互作用对许多细胞过程至关重要，并涉及多种病理生理过程，如癌症、神经退行性疾病等，探究这些作用有助于推动疾病诊断与治疗的新策略。然而，GSL-GBP相互作用的研究受到GSLs纯化困难、弱亲和力和膜环境对结合有影响等多方面的限制。
表面等离子体共振光谱与荧光显微镜等分析方法可估测GBP-GSL结合的动力学与热力学参数，但无法直接识别配体种类与数量，且局限于纯化的GSL混合物。基于微阵列的鸟枪法糖组学策略虽能发现新GSL配体，却受限于GSL修饰需求及低亲和力检测局限。nMS通常涉及电喷雾电离(ESI)-质谱法(MS)分析，使用类似天然溶液的条件和保存非共价复合物的仪器参数进行分析，特别适合研究生物分子相互作用。在这个过程中，GSL配体可以直接从气态GBP - GSL络合离子的分子量中识别出来。对于具有多个结合位点的GBPs，可以使用CaR-nMS方法，通过碰撞诱导解离(collision-induced dissociation, CID)释放GSLs，依据分子量及CID产生的诊断离子进行识别。然而，低亲和力配体的检测仍然是具有挑战性的。理论上，提升GSL浓度可增强对微弱相互作用的捕捉能力，但此举往往伴随着膜模拟物稳定性的急剧下降。因此，亟待开发新的方法来探究低亲和力的GSL - GBP相互作用。
已有研究表明，高亲和力GSL配体可以增强GBP与纳米盘(nanodiscs, NDs)中低亲和力配体的结合。受此启发，作者开发了MEAN-CaR-nMS方法来探究GSL - GBP相互作用。在这一策略中，作者首先用含有NHS酯和炔基的功能化试剂DBCO来标记GBP，然后将其与含有叠氮PE (azidoPE)和GSL的NDs一起孵育，通过无铜点击反应在DBCO和azidoPE之间形成共价键（膜锚）。将GBP锚定在NDs表面，可以极大地提升GBP局部环境中GSL的有效浓度，进而促进GSL和GBP结合(图 1)。
为了证明这一方法检测模型膜中GSL配体的可靠性，作者将8种纯化的神经节苷脂掺入含azidoPE的NDs中，并对未标记和DBCO标记的人半乳糖凝集素-7 (GAL-7)和人半乳糖凝集素-3的C端糖识别结构域(GAL-3C)进行配体识别。结果显示，对于这两种蛋白，MEAN-nMS均检测到与6种具有末端或其他可接近的Gal残基的神经节苷脂的结合(图 2a和2b)，得到的结果与测量的神经节苷脂寡糖亲和力数据完全一致。在此之前，只有GM1被证明是配体。相比之下，未标记的GAL-7完全检测到任何配体的结合，未标记的GAL-3C没有检测到GM1的结合(假阴性)，这表明膜锚的引入显著提高了nMS对GBP-GSL相互作用的检测。
为验证这一策略在配体发现中的有效性，研究团队采用MEAN-(CaR)-nMS技术，聚焦于人类免疫凝集素Siglec-1与SARS-CoV-2的受体结合结构域(receptor-binding domain, RBD)的GSLs结合特性。通过DBCO标记Siglec-1片段，发现8种测试的神经节苷脂均是配体(图2c)，其中，GM3os展现出最高亲和力，与ELISA及亲和力数据吻合。相比之下，未标记Siglec-1则无结合信号，凸显了标记的重要性。进一步，利用猪脑中提取的GSLs混合物组装成的azidoPE-NDs分析，不仅验证了已知结合，还新发现FucGM1与FucGD1的结合(图3a)。同法探究RBD，首次揭示其对FucGD1的结合，拓宽了RBD-GSLs相互作用的认识(图3b)。
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