近期，卡尔加里大学 David Schriemer课题组在Nat. Commun.上发表了题为“Cell fixation improves performance of in situ crosslinking mass spectrometry while preserving cellular ultrastructure”的文章，他们在引入交联剂之前，采取快速的甲醛固定步骤，在保留细胞超微结构的基础下，显著优化了原位交联质谱(in situ crosslinking mass spectrometry, in situ XL-MS)的性能。蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interactions, PPIs) 所构建的网络框架，为我们揭示了细胞执行功能及响应各类刺激的内在机制。交联质谱(XL-MS) 技术，凭借其提供高精度两点间距离测量的能力，已成为生成高质量相互作用数据的强大工具。此外，原位XL-MS实验也已经在众多建模与相互作用研究中发挥了重要作用。然而，传统的XL-MS方法在深入探索空间蛋白质组方面存在局限性。该方法的一个核心要求是交联剂必须能够有效穿透细胞膜。但是常用的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯类交联剂在细胞膜上的渗透性并不理想。因此，为了达到可检测的信号水平，往往需要长时间的孵育过程。但是细胞是一个高度动态的系统，会对化学刺激产生反应，在这段期间内，结构蛋白质组很可能会发生扭曲或变化，进而对分析结果的准确性造成挑战。因此，采取有效策略预先稳定空间蛋白质组显得尤为重要。基于甲醛的固定方法早已在显微镜下细胞固定及生物样本长期保存领域展现出其独特价值，成为备受青睐的稳定手段。甲醛同时也是一种交联剂，稳定机制涉及最初的爆发阶段和长期稳定阶段。在爆发阶段，甲醛交联不同种类的生物大分子，包括蛋白质，但是将其直接应用于XL-MS作为交联剂的多次尝试却均未成功。尽管如此，甲醛在蛋白质和细胞结构的稳定方面依然保持着无可争议的有效性。在这篇文章中，作者提出了一种原位XL-MS方法，在引入基于NHS的交联剂之前使用传统的甲醛固定方案来稳定细胞。令人惊讶的是，高浓度甲醛固定并不会干扰后续的交联反应，更重要的是，当甲醛固定与渗透处理联用时，还能够显著提高交联效率。作者首先使用DSS (一种广泛使用的细胞渗透性交联剂)作为XL-MS的交联剂，探究缓慢交联反应是否会导致空间蛋白质组的扭曲。从图1可以看出，在交联过程中，存在明显的蛋白质组扭曲，约70%的细胞明显受到影响。接下来，作者探究了在细胞固定化之后，是否能实现有效的交联反应。作者使用N-(丙酰氧基)琥珀酰亚胺作为DSS的替代物，这是因为单标记事件相比于交联事件而言，在检测和量化上的优势更为显著。结果显示，甲醛的引入并未对试剂的标记效率产生任何影响，即便浓度提高至4%。此外，标记过程呈现出广泛的覆盖性。在蛋白质组的可检测动态范围内，标记被有效地整合，且在样本分析中并未观察到显著的偏差。值得一提的是，洗涤步骤在此过程中的作用举足轻重。在甲醛存在的条件下，赖氨酸的标记受到了完全的抑制，这与席夫碱的形成机制相吻合。然而，通过在施加DSS之前对细胞进行彻底的洗涤，这一抑制作用得以被有效逆转。随后，作者又探究了固定如何提高交联试剂的渗透性，结果表明，在固定后标记水平显著增加，加入表面活性剂(如triton - x100)来渗透细胞后，标记水平会进一步增加。然后，作者使用图2A所示的工作流程探究了预固定步骤对交联反应产生的影响。他们选用DSS作为交联剂，该交联剂在传统的XL-MS实验中显示出中等水平的交联产率，且检测所得交联产物以环状连接和蛋白质内部连接为主(图2B)。值得注意的是，仅通过固定处理并未显著提升DSS的交联效率，尽管它确实增强了单标记事件的标记效率。然而，在用0.1% Triton-X 100处理固定细胞后，交联谱图匹配(crosslink spectrum matches, CSMs)和唯一交联(unique crosslinks)的数量增加了近两倍。接下来，作者在维持细胞超微结构完整性的基础上，采取三次连续DSS处理的策略。与未经处理的活细胞相比，多次处理使得CSMs的数量增加3倍，独特交联的数量增加4倍，PPIs的数量也增加了约3倍(图2C)。尽管已经可以大幅度提高交联产率，选择性富集策略的引入无疑将为检测过程带来进一步的裨益。在此研究中，作者选择了PhoX交联剂，它含有带负电荷的膦酸盐，可以通过固定化金属离子亲和色谱进行富集。然而，值得注意的是，PhoX交联剂在渗透性方面存在一定的局限性。通过三次连续的PhoX处理，获得的CSMs，独特交联和PPIs的数量均显著增加(图3A, B)。对结果进行深入分析可知，检测到的大多数蛋白质相互作用涉及相对高丰度的蛋白质，例如组蛋白和DNA复制体(图3D)。同时，也成功捕捉到了丰度较低的蛋白质复合物，例如参与DNA损伤修复的Ku70/80异源二聚体(图3E)。该方法实现了交联位点的精准映射，生成了一个距离直方图(图3F)，反映了该方法在结构采样方面的卓越性能。
图3 已固定和渗透的A549细胞与PhoX的原位交联综上所述，原位XL-MS实验有力地证明了预固定细胞在稳定蛋白质组方面的显著效果。与渗透程序相结合，可以显著提高原位XL-MS的诸多关键性能指标，具体体现在反应时间的延长、交联效率的显著提升，以及交联剂应用范围的有效拓宽。这一发展将有助于原位XL-MS发展成为相互作用组分析领域的核心策略。
Professor of Calgary UniversityFounder of INH Technologies Inc. (a biotech startup in Calgary)(1) Integrative structural biology.Using the tools of proteomics, structural biology and computational modeling (AI) to study structure-function relationships in large multicomponent protein systems.Developing new strategies for achieving accurate and comprehensive proteome coverage of clinically-relevant samples, in order to discover and characterize molecular markers of disease.
