小分子与蛋白质的相互作用在药物发现和化学生物学研究中具有重要意义。斯克里普斯研究所化学系的教授Christopher G. Parker在《Nature Chemical Biology》上发表题为“Enhanced Mapping of Small-Molecule Binding Sites in Cells”的文章。作者使用光亲和探针来识别蛋白质上的具体结合位点，并提出了一个名为“Dizco”的新分析流程，该流程能处理由探针修饰的肽段在质谱分析中生成的“嵌合谱”（chimeric spectra）。这种方法使得能够更全面地覆盖探针标记的肽段，并提高标记位置的检测精度。
光亲和探针是一种常用于非共价小分子标记的工具，通过将光反应基团连接到目标化合物上，并在紫外线照射下生成高度活跃的中间体，从而在附近的蛋白质上形成共价键。在本文中，作者设计全功能化片段（fully functionalized fragment, FFF）探针（图1a），这类探针包含一个分子识别基团、一个光反应二氮杂环丙烯（diazirine）基团以及一个生物正交炔基连接手柄。通过在细胞中用探针处理并在紫外线下交联，随后进行铜催化叠氮-炔基环加成反应（CuAAC）标记，捕获结合的小分子与蛋白质相互作用。
实验流程具体为（图1b）先用 FFF 探针处理细胞，然后裂解细胞，通过紫外光下交联铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）"点击"化学反应，将生物素富集标签添加到交联蛋白上。点击反应后，捕获的蛋白质通过链霉亲和素珠子富集，并用胰蛋白酶消化。消化后的肽段用 TMT 试剂标记，然后集中起来进行多重定量蛋白质组分析。将 FFF 探针处理过的样品中蛋白质的报告离子信号与甲基探针处理过的样品进行比较，以确定总蛋白质水平的相对富集程度。
在质谱分析过程中，发现探针标记的肽段生成了嵌合谱（图2d）。这些谱图通常是由于多个非常相似的肽段在色谱上共洗脱，并在质谱分析过程中共分离。这类嵌合谱会导致多个肽段的信号重叠，干扰传统质谱算法对单个肽段的精确匹配（PSM）。为了解决这一问题，作者开发了 multiPSM算法，允许为每个质谱图分配多个肽段序列。multiPSM大幅提高了探针标记肽段的识别率，并为探针标记位点的定位提供了更多数据支持。multiPSM方法允许为一个谱图分配多个肽段匹配。这种策略能够捕获嵌合谱图中的多个潜在标记位点，并提高标记肽段的匹配数。这意味着multiPSM可以在标记肽段的不同位置都分配到肽段匹配，从而更全面地反映探针标记的氨基酸位点（图2b）。multiPSM算法不仅考虑了谱图的多个PSM，还提取了多个关键特征来构建预测模型。第一个关键特征是Delta分数，即谱图中排名前两位的PSM之间的差异分数（图2a），对于标记肽段，delta分数通常较低，因为同一谱图中的多个PSM具有相似的评分；第二个特征是PSM数量，与标记肽段相关的PSM数量往往较高，因为同一个谱图中可能包含多个标记位置（图2d插图）；还有一个特征是保留时间，由于带上标记，导致疏水性增强，保留时间也会与未标记肽段产生差异。通过上述特征的组合，multiPSM方法可以生成高效的预测模型来识别包含标记肽段的谱图。
之后作者通过将Dizco与TMT定量蛋白质组学结合，研究人员能够在不同探针、不同细胞类型和不同浓度下准确量化小分子-蛋白质相互作用的相对丰度。还利用对接分析和结构预测模型alphaFold2，对新发现的小分子结合位点进行结构上的详细解析。发现许多标记位点位于已知的功能性口袋内，如酶的活性位点、辅因子结合位点、蛋白质-蛋白质相互作用位点等。
综上作者通过开发新的Dizco分析流程，在蛋白质组范围内实现了更高分辨率的小分子结合位点映射。这一方法在药物发现、蛋白质功能解析及化学蛋白质组学领域具有广泛的应用潜力。
编辑：苗腾元
Christopher Parker, PhD
Professor，Department of Chemistry at The Scripps Research Institute
Background
Ph.D. (Chemistry), Yale University, 2013
B.S. (Chemistry), Case Western Reserve University, 2007
Research Focus
Research integrates organic synthesis with chemical proteomics and cell/molecular biology to (1) to study how small molecules might regulate, or be designed to regulate, complex biological processes such as immune responses and, (2) illuminate molecular mechanisms that contribute to disease.
