在生物大分子复合物的研究中，通过二硫键连接的多聚蛋白的分析面临着重大挑战。使用碰撞碎裂技术解析其四级结构时，共价的二硫键稳定而不易解离，非共价作用则稳定性低更易解离。对于超过100 kDa的大分子复合物，现有的基于电子的离子碎裂技术的应用也受到限制。近期马萨诸塞州立大学艾莫斯特分校的Igor A. Kaltashov课题组在Analytical Chemistry上在线发表了题为“Probing the Architecture of Multisubunit Protein Complexes with In-line Disulfide Reduction and Native MS Analysis”的文章，通过在线缓冲交换和交叉路径反应色谱平台（XPRC），在非变性条件下化学还原二硫键，随后利用Native MS对生成的复合物片段进行表征，以识别相互作用的蛋白单元。
作者首先在二硫键还原后保持稳定的系统中探测四级结构以验证可行性，即一个先前表征的抗原/抗体系统：一个FITC-FLAG肽和一个单克隆抗-FLAG M2抗体。Native MS检测FITC/FLAG M2混合物显示了2:1和1:1抗原/抗体复合物的存在，以及无抗原的抗体，离子丰度比为2:9:7。为了使用TCEP或DTT还原抗体内链间二硫键的过程中保持抗原/抗体复合物的完整性，需要仔细控制溶液的pH值和离子强度，使其接近生理水平。添加最多20%的乙腈有助于二硫键的还原，通过蛋白离子的电荷状态分布分析可知，该浓度的有机溶剂不会导致三级结构的降解。在20%乙腈中与500 mM DTT孵化后，通过在线缓冲交换和Native MS得到的FLAG/M2混合物的质谱图如图1所示。在质谱图中可以清晰地分辨出三组离子峰。在m/z 5,000-7,000的峰代表了未还原的FLAG/M2混合物；m/z 3,500-5,000的峰代表了在还原重链间（H-H）二硫键后产生的抗体重-轻链片段（HL片段）；m/z 1,500-3,500的峰代表了抗体的无抗原L链，而与抗原结合的L链的丰度要低得多。L链无法保留抗原的能力，指向保持完整的HL复合物对于M2/FLAG相互作用的绝对要求，与晶体结构一致。
图1 FLAG/M2结合体二硫键混合物Native MS谱图
作者信息
Igor A. Kaltashov
Professor in Chemistry at UMass-Amherst
Bachelor’s degree in physics at Moscow Institute of Physics and Technology in 1989
Ph.D. degree from the University of Maryland Baltimore County in 1996
Post-doctoral fellow at Johns Hopkins Medical School
Research interest focused on developing mass spectrometry-based experimental techniques to study structure, conformation, dynamics and interactions of biopolymers.
