Nat. commun.| 剖析双吖丙啶光反应机制，用于蛋白质残基特异性交联和距离映射

学术 2024-07-26 13:50 北京

近期，北京大学化学与分子工程学院唐淳教授课题组在Nature Communications上发表了题为“Dissecting diazirine photo-reaction mechanism for protein residue-specific cross-linking and distance mapping”的文章，他们开发了一种光强度和时间可调的在线反应系统，详细剖析了烷基双吖丙啶的光解及其与蛋白质残基的反应机理，并进一步用残基特异性光交联(photo-cross-linking, PXL)评估蛋白质结构。

化学交联（Chemical Cross-Linking, CXL）技术凭借其操作简便性与分析流程的高度标准化特性，正日益成为探究蛋白质及其复合物结构与动力学特性的强大工具。尽管如此，相较于PXL技术，CXL在展现其优势的同时，也面临着反应时间较长、所能探测的残基间距离较长使得提供的结构约束相对较弱等局限性。反观PXL技术，尽管其具备潜在的高效性，但其反应过程可能表现出高度的非均一性，导致生成包含多种蛋白质残基组合的复杂混合物。此外，由于当前对光化学反应的精确机制及产物生成的量化理解尚不充分，PXL在蛋白质结构解析领域的广泛应用遭遇了一定程度的阻碍。特别地，双吖丙啶作为光化学领域内广泛应用的关键官能团，其经辐照后能够诱发复杂的化学过程，包括重氮中间体及卡宾中间体的生成。然而，关于这两种关键中间体是如何产生的、它们之间的相对产率，以及它们对蛋白质特定残基的偏好性等问题尚不明确，亟待深入探索与揭示。

双吖丙啶在捕获光子能量时，其光解过程可能遵循图1中所示的四种潜在机制之一。其中，模型I是模型II的简化版本，缺少烷基双吖丙啶A直接到卡宾中间体C过程。模型III假设重氮中间体B到卡宾中间体C过程在没有辐照的情况下自发发生，而模型IV则不涉及B到C的过程。为了确定哪个模型最能描述烷基双吖丙啶的光解机制，作者建立了一个实时光反应系统，使用磺基琥珀酰亚胺 4,4'-叠氮戊酰胺(sulfo-SDA)作为光交联试剂，并结合了在线质谱检测。通过比较理论曲线和实验数据，他们最终确定模型II最适合于解释sulfo-SDA的光解机制。

图1 烷基双吖丙啶可能的光解机理

随后，作者深入探索了在不同光功率密度[hv]与照射时间t的条件下，SDA与AXA三肽（简称HY，其中X代表任意氨基酸）之间的光化学反应动力学（图2a）。为确保实验条件接近生理状态，三肽分子经过了N端乙酰化和C端甲基化处理，这样的设计使得残基X能够更真实地模拟蛋白质环境中的氨基酸残基。SDA与HY之间的交联反应，其核心机制涉及重氮中间体B与卡宾中间体C的介导作用。具体而言，Ib1和Ib2分别描绘了三肽HY的质子化形式与B的直接反应，以及HY的Y-去质子化形式与B的反应；而Ib3和Ib4则代表了相应的质子催化过程。另一方面，Ic则直接展示了卡宾中间体C与HY的交联反应。作者发现，对于脂肪族及非极性残基（如Gly、Ala等），其b1 + b2 + b3 + b4 - c值趋近于-1，这一结果强烈暗示了在这些情况下，SDA-HY的交联产物主要由卡宾中间体C介导生成（图2d）。相反，对于极性残基（如Ser和Thr），该值则接近1，表明SDA-HY的交联过程更多地依赖于重氮中间体B的介导。为了进一步优化极性残基的选择性交联效率，作者提出了一个策略：即采用更高的光功率密度[hv]配合较短的辐照时间t（图3）。此外，作者还注意到，大多数交联位点倾向于位于蛋白质分子的相对疏水区域，说明水分子与交联反应位点之间存在显著的竞争关系。

图2 剖析烷基双吖丙啶与蛋白质残基的反应机理

图 3 SDA-HY的产率与辐照时间t和光功率密度[hv]的关系

接下来，作者使用SDA对9种模型蛋白进行了PXL实验，然后使用pLink263(一个主要用于分析CXL谱图的搜索引擎)分配交联肽谱图。他们发现，在较低的光功率密度[hv]条件下，交联反应中Asp、Glu和Tyr等极性残基的丰度远超其在蛋白质中的自然丰度（图4a）。与此同时，对于含有较少极性残基的环状肽链，其交联产物的百分比则普遍低于相应的自然丰度（图4c）。为了深入理解这些交联事件的结构基础，作者又基于蛋白质结构计算了交联残基间的Cα-Cα距离(图4d)，结果显示，与Glu、Tyr和Asp相关的PXLs的计算距离与蛋白质结构基本一致，而涉及Thr的大部分PXLs是超长的。此外，位于较为隐蔽位置、溶剂暴露度较低的残基更倾向于发生交联反应，这为获取高质量的结构约束提供了重要线索。以牛血清白蛋白（BSA）为例，尽管K245和K297均位于螺旋结构中，但由于K245的隐蔽性更高，其参与形成的PXL残基对及匹配的质谱信号强度是K297的两倍之多（图4e）。最后作者利用这些独特的高质量特异性交联数据，成功地对蛋白质结构进行了距离映射（图4f）。

图 4 在9种测试蛋白中烷基双吖丙啶优先交联极性残基

综上所述，作者建立了一个光强和时间可调的光化学反应系统，对光反应进行在线实时监测。结果表明，在烷基双吖丙啶的光解中，重氮和卡宾中间体按顺序生成，并且重氮中间体优先且特异性地与蛋白质极性残基反应。作者还进一步用残基特异性PXLs对蛋白质结构进行了距离映射，为更精确、详细的蛋白质质谱结构分析奠定了基础。

编辑：万巍

审核：乔利鹏

作者信息

唐淳

北京大学化学与分子工程学院教授

研究领域：

（1）发展生物磁共振技术，开发顺磁探针，发展相应的计算方法，表征蛋白质、RNA等生物大分子的动态结构、动态互作。

（2）发展整合核磁共振与小角散射（SAXS）、单分子荧光（smFRET）、质谱交联（XLMS或CXMS）实验与计算方法，发展质谱交联数据的定量分析方法和人工智能算法，表征非平衡态下的生物大分子的动态结构。

（3）探究化学修饰、物理化学环境等对生物大分子结构动态的影响，重点关注泛素化、磷酸化和甲基化的调控作用。

瑕瑜课题组

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