近期，深圳大学和大连理工大学Xiaojun Peng和Xiaoqiang Chen合作开发了一种基于吡唑酮分子的非共价细胞膜功能化方法，通过与膜蛋白稳定结合，实现了精确且持久的细胞追踪，并展示了在细胞膜上方便地创建生物识别的潜力。该方法既确保了蛋白功能的完整性，又避免了细胞死亡问题。该文章于近期发表在JACS上，题目为“Pyrazolone-Protein Interaction Enables Long-Term Retention Staining and Facile Artificial Biorecognition on Cell Membranes”。
作者最初观察到吡唑酮功能化的尼罗蓝染料（NBS–N-P）定位于细胞膜上，而不是像以往报道的尼罗蓝染料那样进入细胞溶酶体（图1a）。为验证吡唑酮在细胞膜定位中的作用，作者合成了一系列不同末端的尼罗蓝衍生物，并在HepG2细胞中进行了成像实验。结果显示，带有吡唑酮结构的衍生物具有显著的细胞膜染色特性，而不依赖于电荷相互作用。此外，通过1H NMR光谱分析，作者发现吡唑酮在水溶液中以烯醇异构体形式存在，其α-C位点的活性氢可能是其与细胞膜结合的关键（图1b）。进一步的实验表明，封闭吡唑酮的活性位点会导致染料无法染色细胞膜，验证了吡唑酮在识别膜蛋白中的重要作用。
图1. a)吡唑酮结构及其衍生物会定位标记在细胞膜；b)1H NMR光谱分析吡唑酮在水中的存在形式； c）结合多种染料的吡唑酮结构均会定位标记在细胞膜上。1
H NMR
为了深入了解吡唑酮功能化染料与细胞膜的相互作用，作者首先在HepG2细胞中进行了细胞组分的提取实验，以识别与吡唑酮染料直接结合的物质。通过荧光信号的分析，发现NBS–N-P的主要荧光信号集中在细胞膜上，而在细胞质或其他细胞器中几乎没有信号，这与显微镜观察的结果一致。进一步对膜成分的分离显示，NBS–N-P主要与膜蛋白结合，而非磷脂，这一发现表明，吡唑酮功能化分子更倾向于与膜蛋白相互作用（图2a-d）。
此外，作者还发现NBS–N-P无法在细胞连接区域染色这些区域的膜蛋白，这些区域的膜蛋白因受到结构阻碍而无法被吡唑酮功能化分子触及；相比之下，DiO染料因磷脂的高流动性而在这些区域未受影响地进行染色。这一发现表明，吡唑酮功能化分子与膜蛋白的结合不同于传统的磷脂插入法，进一步支持了其作为一种新型膜蛋白识别方法的独特性。
图2. a-d)分离细胞成分或原位荧光标记以观察吡唑酮染料在细胞膜的结合位置；
为了深入研究吡唑酮与蛋白质之间的相互作用，作者通过等温滴定量热法（ITC）对吡唑酮功能化染料与19种天然氨基酸的相互作用进行了评估。结果表明，吡唑酮功能化染料与碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸和组氨酸）以及酰胺基氨基酸（如天冬酰胺和谷氨酰胺）形成了高效的结合，并伴随负的吉布斯自由能变化（图3a）。这种结合的焓变可能来自于氢键和静电相互作用等弱相互作用。其中，精氨酸表现出与Py-COOEt的最高亲和力，吉布斯自由能变化（ΔG）达到−10.54 kcal/mol，这种结合的稳定性可与生物素-亲和素相互作用相媲美。
图3. a)吡唑酮与19种天然氨基酸共结晶；b）等温低定量热衡量吡唑酮功能化染料与19种天然氨基酸的相互作用； c)高效液相色谱分离BDP_N_P和赖氨酸精氨酸相互作用复合物； d)ITC 分析中 Arg 和 Py-COOEt的微分功率曲线随时间变化及热量变化曲线随摩尔比的变化；e)[Arg+Py-COOEt]+ 的 MS-MS 分析；f)负电吡唑酮的静电势及互变异构体; g)吡唑酮与 Arg 之间多重弱相互作用的示意图及通过 IGMH 方法模拟的弱相互作用
此外，高效液相色谱（HPLC）分析进一步验证了吡唑酮与精氨酸和赖氨酸之间的结合，分别在5.88和5.95分钟处出现了BDP–N-B/精氨酸或赖氨酸复合物的峰值，而在其他氨基酸的分析中未发现新的峰值。这进一步确认了吡唑酮与特定氨基酸之间的选择性结合。
为了深入探讨吡唑酮与精氨酸结合的模式，作者进一步研究了两者的相互作用。ITC结果显示，精氨酸与吡唑酮的结合比为1:1。此外，质谱分析也确认了精氨酸和Py-COOEt以1:1比例形成的复合物的质谱峰（m/z 359.21），该复合物在串联质谱（MS-MS）中解离成精氨酸（m/z 175.13）和Py-COOEt（m/z 184.08），再次验证了两者之间的非共价结合。
值得注意的是，弱酸性的Ha去质子化导致了负电荷的吡唑酮结构，其pKa值为7.2。通过Gaussian 16W和IGMH方法进行的模拟表明，去质子化的吡唑酮中的电负性氧原子和电正性Hb与精氨酸中的胍基通过盐桥和氢键相互作用，这与1:1的结合比一致。双重非共价键解释了精氨酸-吡唑酮结合的优越稳定性，而这种优越的稳定性确保了吡唑酮功能化分子能够稳定结合到细胞膜蛋白上。
该方法具有快速且持久的细胞膜定位优势，克服了传统基于磷脂插入机制的商业膜染料迁移问题，能够在不影响蛋白功能或细胞存活的情况下，实现体外超过96小时和体内超过21天的精确细胞追踪。此外，该方法还可以轻松赋予细胞生物识别功能，无需复杂的化学或基因工程操作，为细胞膜工程在生物应用中的发展提供了理想的新工具。
编辑：王紫丹
审核：王祎纯
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作者信息
彭孝军教授
教授、博士生导师，大连理工大学；1993-1996年：大连理工大学副教授；1996年起：大连理工大学教授；1997年起：精细化工国家重点实验室主任、教授；2001年：瑞典斯德哥尔摩大学访问学者。
研究方向：染料的光化学；用于生物成像和生物标记的荧光染料；精细化学品的清洁制备技术
陈小强教授
深圳大学特聘教授。2007年12月于大连理工大学精细化工国家重点实验室获得工学博士学位，师从彭孝军院士；2008年-2010年在韩国梨花女子大学纳米科学部Juyoung Yoon教授课题组从事博士后研究；2010年入职南京工业大学，2022年到深圳大学材料学院工作。
研究方向涉及有机/超分子光化学、化学与生物传感器、智能递送材料等领域。
