近期德布勒森大学的Attila Gáspár的科研团队在Analytical Chemistry期刊上发表题为“Taylor–Aris Dispersion-Assisted Mass Spectrometry for the Analysis of Native Proteins”的文章。Taylor-Aris Dispersion-Assisted质谱法 (TADA-MS) 可以使分析基质中大分子直接注入质谱进行测定。研究了天然条件下存在的不同类型的蛋白质和蛋白质复合物的行为，表明了该方法的明显优势。
在物学相关的天然构象（三级或通常为四级结构）下研究蛋白质可以更好地理解和揭示蛋白质的生物学功能。目前的质谱分析方法分析蛋白质都有所局限，电喷雾电离 (ESI) MS 通常采用使蛋白质变性的苛刻条件，Native MS 则只是保持ESI 之前溶液中蛋白质/蛋白质复合物的状态，无法模拟生理环境。先前研究表明ESI-MS 可用于液体溶液中的蛋白质的天然分析，因为在测量过程中溶液相蛋白质的结构在动力学上被捕获在气相中。然而，当蛋白质在模拟生理条件的溶液中被引入 MS 时（通常使用非挥发性盐，如 pH 为 7 的磷酸盐或含有∼150 mM NaCl 的 Tris 缓冲液），就会产生严重的干扰。这些盐的存在会导致灵敏度急剧下降。因此想要高精度分析Native状态下的蛋白质，需要对现有技术进行革新。作者发现Taylor-Aris Dispersion在避免 ESI-MS 测定大组分时可以避免信号干扰问题。该方法样品在进入ESI前加一个毛细管，利用样品中蛋白质和基质组分之间的巨大扩散常数差异（图 1），可以直接从其配方缓冲液中分析蛋白质。如图1所示，在毛细管层流下，这种效应导致前部和尾部区域的大分子（蛋白质）和小分子部分分离，因此分析前无需进行预分离或纯化。
图1 不同尺寸分子的Taylor–Aris Dispersion示意图作者首先使用Native TADA-MS对单克隆抗体（mAb）药物进行分析。商业可得的mAb中不兼容 MS 的成分含量较高，无法用于直接输注实验。作者对单克隆抗体药物ramucirumab小样品塞进行了 Native TADA-MS 分析，得到了典型的强度分布数据图（图2）。样品塞前部的 ESI-MS 信号比中部高得多 (图 2a)。在前部获得的质谱清晰且易于评估，这表明该区域含有纯净形式的 mAb (图 2b)。解卷积光谱中的主要峰（图 2b,d) 可在 146595.0 146754.4、146916.7 和 147078.7 Da 处观察到，分别对应于 G0F/G1F、G1F/G1F 或 G0F/G2F、G2F/G1F、G2F/G2F 糖型。然而，由于样品基质（盐、缓冲化合物和去垢剂）造成的强烈干扰（离子抑制和许多不同加合物离子的形成），在样品塞的中部没有观察到抗体信号的痕迹 (图 2c)。样品塞的后部也显示出清晰的 mAb 光谱（图 2d），可能的原因是 TA 分散的前区和后区的纯度水平相似。在 TADA-MS 测量中，还可以检测到 mAb 二聚体（图 2b、d 的插图）。Ramucirumab的 TADA-MS 分析可以测定完整 mAb 的分子量，同时在天然条件下，也无需应用任何常见的初步基质去除程序，具有可辨别的糖基化模式。而在直接进样而不利用 TADA 的情况下，无法提供所研究 mAb 的完整分子量或糖基化模式。
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图2 Ramucirumab的Native TADA-MS 分析
接下来作者对具有四级结构的刀豆凝集素 A（Con A）进行Native TADA-MS分析。Con A 是一种凝集素，能特异性识别甘露糖和葡萄糖。Con A 的不同寡聚体（二聚体、四聚体和六聚体）可以在溶液中共存，它们的相对量取决于蛋白质浓度和基质材料。四聚体具有球状结构。Con A 的碳水化合物结合亲和力取决于 Ca 2+和 Mn 2+离子，因为金属离子可以稳定蛋白质的结构。在用 TADA-MS 对 Con A 进行天然分析时，二聚体和四聚体成分提供强信号，而单体和六聚体形式的信号强度则小得多（图 3b）。在对蛋白质变性直接注入 MS 测量的情况下，无法检测到四聚体（图 3a）。在变性模式下，二聚体和单体是可检测到的，并且两个水解亚基中的一个产生最高强度的信号（图 3a 中的 7+、8+ 和 13+ 电荷状态）。这两个水解亚基是在蛋白质成熟过程中形成的。在Native TADA-MS 测量中，四聚体和二聚体的主要电荷数分别为 21+ 至 23+ 和 15+ 至 16+。需要指出的是，四聚体和二聚体的理论主电荷数分别为 25+ 和 18+。由于这些电荷数的计算是基于蛋白质的球形，TADA 测量可能表明 Con A 具有更球形的形状。由于二聚体和四聚体的峰较宽（由加合物形成引起），而单体的强度较低，因此无法在天然光谱中证实与蛋白质相关的金属离子的存在。施加源内碰撞诱导解离的能量，让低聚物解离，得到单体 Con A 的模拟光谱（图 3d），在加入金属离子Ca 2+和 Mn 2+离子后，模拟光谱发生变化（图 3f），证实其可以识别这些金属离子。![]()
图3 Con A的 Native MS 分析和Native TADA-MS 分析
综上，作者证实了 TADA-MS 在天然蛋白质分析中的优良性能。TADA-MS 能够大大减少基质干扰，检测灵敏度显著提高，且在分析过程中可以使用更多“类似天然”的条件；允许将非质谱兼容基质直接注入质谱，使得工作流程简化和经济化。
编辑：苗腾元
University of Debrecen, Faculty of Science and Technology, Institute of Chemistry, Department of Inorganic and Analytical Chemistryfundamental research on the fields of microfludics/lab-on-a-chips, electromigration separation methods, glycoenzyme research and special fields of environmental analysis, which are all emerging
