雌激素在内分泌和肿瘤相关研究中发挥着重要作用，虽然LC-MS已成为研究雌激素的有力工具，但由于雌激素内源性浓度低、电离效率低、仪器灵敏度限制等原因，通常需要对雌激素进行化学衍生化修饰。然而，常见衍生化试剂（如羟胺、吉拉德试剂 P、2-肼基吡啶丹磺酰氯等）由于季铵基团引起的基质效应，会严重抑制目标分析物的检测。近期，上海有机所郭寅龙教授课题组开发了一种新型衍生化试剂--噻蒽（TT），利用电化学方法将其氧化为自由基阳离子（TT•+），并在课题组前期搭建的激光烧蚀-电化学碳纤维电离（LA-ECCFI）MSI 平台上完成了雌激素的在线电荷生成衍生化，成功将靶向雌激素的成像灵敏度提高了3个数量级。相关成果发表在Analytical Chemistry中，文章题为“Online Charge-Generation Derivatization by Electrochemical Radical Cations of Thianthrene: Mass Spectrometry Imaging of Estrogens in Biological Tissues”。
如图1所示，激光烧蚀-电化学碳纤维电离（LA-ECCFI）MSI 平台将电解池与 LACFI-MSI平台相耦合。电化学池由PEEK十字接头和铂电极组成。衍生化试剂可以通过注射泵由管路水平一侧注入，其中注射器通过金属毛细管和连接头与十字管路相连，在管路水平另一侧，链接了碳纤维离子源（CFI）尖端。作为电解池阳极的铂线从管路垂直穿过，阳极电压（优化后设置为25 V）由外部电源提供，而阴极电压在CFI喷雾高压下浮动。
作者所开发的衍生化试剂TT具有较低的氧化电位 (ETT•+/TT = 0.99 V vs Fc/Fc)，且对于雌激素的酚环结构具有高度靶向性。具体工作流程为，组织样品表面的分析物在450 nm激光的照射下发生解吸附。与此同时，TT 被泵入电解池，在阳极发生电氧化过程，生成TT•+，并从碳纤维尖端喷出。之后解吸附的样品分子与气相TT•+发生在线化学衍生化反应，最后通过质谱分析带正电荷的衍生化产物。
在 LA-ECCFI MSI 平台上利用 TT 对雌激素进行在线电荷生成衍生化的机理如图 2a 所示，作者通过比较施加阳极电压谱图的变化验证这一机理。在施加电压后，TT•+（m/z 216.0071）绝对信号强度高达2.6×106。相反，当撤去阳极电压后，溶剂峰占主导地位，TT•+的绝对信号强度仅为 104。这表明电化学池将TT•+的生成效率显著提高了 2 个数量级，确保了后续衍生化反应的高转化率。随后，作者利用10 ng/μL TT（优化后）分别与d5-苯酚、 d4-雌二醇在线衍生化，结果显示TT•+ 可与酚羟基C2位C-H发生反应，同时类固醇骨架中 C2 位的空间立体位阻较小，这提高了反应的可行性。具体机理为，中性分子TT通过电化学池发生氧化，原位生成TT•+。TT•+与解吸附的雌激素中富电子的芳环发生亲电取代反应，实现对雌激素的永久电荷标记。
作者还以雌酮、雌二醇和雌三醇为标准，比较了TT与其他衍生化试剂对雌激素的衍生效率，结果显示TT的在线衍生化效率最高，适用于雌激素的在线质谱成像（图2b）。除此之外，作者利用ESI喷针替换CFI喷针（图2c），电化学方法促进了ESI离子源中高丰度的TT•+的电离（图2d），与未施加阳极电压相比，TT•+绝对强度大大提高。这表明该电化学池具有应用于各种大气压离子源TT电氧化的潜力。但是作者也发现，与ESI相比，CFI在雌激素衍生化方面表现出更高的效率。这可能是由于ESI电离为吸热过程，不利于化学反应，而CFI电离涉及放电，为放热过程。因此，CFI尖端放电可以改善气相化学反应的微环境，促进衍生化。
随后，作者在最佳条件下，研究了LA-ECCFI MSI平台上TT在线雌激素衍生化的成像灵敏度和线性关系。图 3a-c 显示了 不同雌激素在 TT 衍生前后的 MS 图像。在衍生化后，成功将质量信号提高约 3 个数量级（100 ng/μL→0.1 ng/μL）。衍生化产物的质量强度随浓度的增加而线性提高（在 0.1-100 ng/μL 浓度范围内线性关系良好，R2 > 0.99）（图 3d-f）。
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