定量蛋白质组学在生物标志物发现和医学诊断进步中扮演着极其重要的角色。同量异序标签（isobaric labeling）是一种基于串联质谱(MS/MS)的大规模定量蛋白质组学分析的高通量技术。同量异序标签包含重同位素，如15N、13C、18O和2H，被化学修饰到酶解生成的肽段上,气相碎裂时产生用于定量蛋白质的相对丰度报告离子。该技术在不增加谱图复杂性的同时提供多通道分析，提高分析通量，减少检测时间，并提高蛋白质组覆盖深度。目前已有TMT、iTRAQ、DiART、IBT和DiLeu等多种标签，商业可得的iTRAQ和TMT通过引入昂贵的13C和15N同位素来提高多通道能力，但产量相对较低，如6-plex TMT试剂的总产量不到1%。相对低成本的18O原子也可以化学引入标签的平衡基团中，如iTRAQ和DiLeu。现有的这些定量方法的灵敏度仍不够高，准确定量和深度覆盖微量蛋白质仍然是巨大的挑战。厦门大学的高祥教授与赵玉芬院士课题组合作在Analytical Chemistry上发表了题为“6‑Plex Tandem Phosphorus Tags (TPT) for Accurate Quantitative Proteomics”的文章，合成了新型的串联磷标签(TPT)，引入15N和18O同位素原子形成报告离子，提高磷试剂的通道，使用标准蛋白质和HeLa细胞蛋白质，系统地评估了TPT试剂的定量准确性。
6-Plex TPT试剂结构为二乙氧基N-磷酰化丙氨酰甘氨酸（DEP-Ala-Gly），包含三个关键结构，磷酰胺为报告离子基团，二肽为平衡基团，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯的反应性基团(如图1所示)。报告离子（C6N1O3）包含三个氧原子和一个氮原子，使用15N和18O标记的组合可以提供m/z 180-185的6通道。
图1 TPT试剂结构及报告离子的精确质量
TPT试剂的合成关键是将18O原子有效地引入报告离子中。三乙基磷酸酯被H218O水解以获得18O-亚磷酸二乙酯（DEPH），在98%的产率下实现了一个18O原子的标记；在硝酸银存在下，碘乙烷与H218O交换以产生18O标记的乙醇，这又可以与二苯基磷酸酯反应生成含有两个18O原子的18O2-DEPH。Fmoc-15N-Ala在酸性H218O中孵化以形成Fmoc-15N-Ala-18OH，与甘氨酸缩合得到Fmoc-15N-Ala-18O-Gly-OH，被酸性H218O催化生成Fmoc-15N-Ala-18O-Gly-18OH。最后将各模块连接，生成同位素标记的DEP-Ala-Gly-NHS的TPT试剂，最终产物同位素富集度高达97%。通过引入不同的18O和15N标记组合，在报告离子和平衡基团中设置了5 Da的质量差。等比例混合6-Plex TPT试剂的ESI-MS分析显示，m/z 385.1278的[M + H]+离子可以通过MS/MS碎裂产生从m/z 180-185范围的六个报告离子，强度非常相似。将来自BSA的六个等分的胰蛋白酶肽段分别单独用6-Plex TPT试剂标记，然后独立使用nanoLC-MS分析，使用每个6-Plex标签标记的BSA样品的蛋白质序列覆盖率超过78%（如图2所示）。
综上所述，作者发展了基于磷酸化标记的6-Plex TPT试剂，用于超灵敏蛋白质组定量，6-Plex TPT试剂使用H218O作为关键材料进行18O标记，而不是昂贵的稳定同位素13C来构建标签。评估6-Plex TPT试剂的性能表明，TPT试剂可以为大规模蛋白质定量提供高准确性和重复性，有潜力用于高灵敏度的微量蛋白样品的高通量定量蛋白质组学分析。
高祥
厦门大学药学院教授
厦门大学化学系，博士，2007-2010
厦门大学化学系，硕士，2004-2007
西南大学化学系，学士，2000-2004
研究方向：
1、定量磷试剂质谱技术：蛋白质组学、代谢组学；
2、生命有机磷化学：含磷生物分子功能与化学进化；
3、基因转录调控机制与药物发现：多肽药物研发。
赵玉芬
中国科学院院士
台湾新竹清华大学化学系理学学士1967-1971
美国纽约州立大学石溪分校化学系理学博士1971-1975
纽约州立大学石溪分校化学系博士后1976-1977
纽约大学化学系博士后1977-1979
研究兴趣：生命有机化学，有机磷化学，生命起源，药物化学，化学生物学
