α-螺旋作为蛋白质中最为丰富的二级结构之一，在介导蛋白质-蛋白质相互作用方面发挥着关键作用，其广泛参与了众多生理过程的调控，包括细胞信号传导、免疫应答、物质运输等。众多肽激素需形成α-螺旋才能与受体结合发挥作用，然而，从蛋白质中分离出的肽常失去α-螺旋结构及结合能力。现有的稳定方法存在诸多问题，破坏天然相互作用或效率低，且稳定长肽α-螺旋同时不影响其与受体结合仍是难题，这严重阻碍了生物应用和药物开发。近期，厦门大学吴川六课题组与复旦大学王明伟课题组合作在J. Am. Chem. Soc. 期刊上发表了题为“Disulfide-Directed Multicyclic Peptides with N-Terminally Extendable α-Helices for Recognition and Activation of G Protein-Coupled Receptors”的文章，提出了一种综合的化学设计和文库筛选方法，设计和发现了一种独特的二硫键稳定的多环肽支架，该支架能够容纳扩展的肽α-螺旋，同时在二硫键配对和肽折叠方面显示出极高的效率。
研究团队利用半胱氨酸基序（如 CXC、CPPC 和 CPXXC）来定向肽的二硫键配对和折叠，设计了一类新型的二硫键导向多环肽（DDMPs）。在此前已有的DDMP中，α-螺旋被限制在支架内，使得外源性α-螺旋的直接移植变得复杂。为了构建含可扩展N端α-螺旋的DDMP支架，研究者采用了分割和嫁接策略。具体而言，他们选取了一个内部含有α-螺旋的现有DDMP支架，将其C末端α-螺旋末端的两个孤立半胱氨酸残基之间的中央环进行分割，随后通过一个柔性的5残基肽段-GSGSG-连接肽原有的N端和C端（如图1所示）。这使得支架能够接纳N端可扩展的α-螺旋，拓展了其功能多样性与应用潜力。
图1 分割和嫁接策略构建N段可扩展的DDMP
为筛选理想支架，研究团队构建了噬菌体展示文库，选取具有α-螺旋结合口袋的模型蛋白（如MDM2、PD-L1）作为筛选靶标。在文库L1中，除了移植的5残基环外，N端α-螺旋和C端不规则环均进行随机编码。经过三轮严格的筛选，成功鉴定出两个序列（m1和m2），它们展现出MDM2的特征性保守结合基序。以筛选得到的序列为基础构建新的文库（如L2、L3），以进一步探索支架的特性，最终鉴定出三个高度富集的序列（p1、p2和p3），它们在氧化还原缓冲液中均表现出较高的氧化折叠效率，验证了CPXXC基序出色的二硫键导向作用。最终利用NMR进行三维结构表征，并与AlphaFold2的预测相对应，验证了序列的正确折叠与二硫键的正确连接（如图2所示）。
图2 p1:Ox的预测结构与NMR实验结构
许多肽激素在与受体结合时会形成长α-螺旋结构，但未结合时结构不稳定，研究团队将以GLP-1为模型，将其整合入DDMP支架设计激动剂。先通过表面等离子共振（SPR）评估GLP-1及其截短形式与GLP-1R的胞外结构域（ECD）结合亲和力，GLP-1截短后亲和力丧失。将截短的GLP-1整合到支架中，调整α-螺旋方向，利用AlphaFold2预测结合构象，筛选优化。构建文库L5对DDMP支架残基随机突变筛选，得到g1、g2和g3，其中g1:Ox表现出与GLP-1相当的活性。通过圆二色谱（CD）光谱测量g1:Ox和GLP-1的螺旋度，发现g1:Ox在溶液温度达到70°C之前具有显著高于GLP-1的α-螺旋度，表明g1:Ox具有较高的热稳定性。在模拟肠液（SIF）中含有0.01 mg/mL胰蛋白酶的条件下，比较g1:Ox和GLP-1的化学稳定性，发现g1:Ox的半衰期为36.0分钟，显著高于 GLP-1的2.6分钟。
为了深入揭示g1:Ox与GLP-1R之间的相互作用机制，研究团队运用冷冻电镜技术解析了g1:Ox-GLP-1R复合物的结构，在3.0 Å的分辨率下，g1:Ox结合的GLP-1R结构与GLP-1结合的相似，g1:Ox的C 端有额外相互作用，形成复杂极性网络，增强了结合能力（如图3所示）。
图3 冷冻电镜表征g1:Ox与GLP-1R复合物的结构
综上所述，该工作通过理性设计与文库筛选相结合的方法，成功构建了含可扩展N端α-螺旋的DDMP支架，将其应用于肽激素GLP-1的α-螺旋结构，所开发出的GLP-1R激动剂在α-螺旋度、蛋白水解稳定性以及受体激活活性等方面均表现出色。
编辑：周柯汀
审核：乔利鹏
作者信息：
吴川六
厦门大学化学系，教授
Postdoc, ETH Zurich (2010–2012)
Research Assistant, National University of Singapore (2008–2009)
Ph.D., Xiamen University (2005–2010)
B.S., Xiamen University (2001–2005)
Research: Peptide Ligands and Drugs; Oxidative Folding of Polypeptides; Fluorescent Probes
王明伟
复旦大学基础医学院药理学系，讲座教授
1978.02—1982.12上海第一医学院医学专业本科生
1986.10—1989.11英国剑桥大学生理学博士研究生
研究方向：新药筛选和基础药理学研究
