近期，德克萨斯大学奥斯汀分校的Jennifer S. Brodbelt课题组在Analytical Chemistry上发表了题为“Investigating Lipid Transporter Protein and Lipid Interactions Using Variable Temperature Electrospray Ionization, Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry, and Collision Cross Section Analysis”的文章，他们利用非变性质谱法(native MS)和紫外光解(UVPD)表征了MlaC蛋白的内源性结合脂质，实现了脂质结合位点的定位。细菌感染每年导致全球超过13%的死亡，其中革兰氏阴性菌感染尤为严重，因其对多种抗生素表现出耐药性。革兰氏阴性菌具有独特的外细胞膜（outer cellular membrane, OM），其与脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）不对称组装，阻止抗生素进入细胞。虽然LPS是OM的关键特征，但是甘油磷脂（Glycerophospholipids, GPLs）同样扮演着不可或缺的角色，它负责维持OM的内膜、质周侧和细胞外侧的短段。如果过量的GPLs积聚在OM的细胞外侧，会导致OM更易被抗生素渗透。Mla是维持脂质不对称的蛋白质系统，它可以从OM的细胞外侧去除错位的GPLs，维持其不对称性。Mla系统是一个由六种蛋白质——MlaA至MlaF构成的复杂体系，这些蛋白质自外细胞膜（OM）延伸至内膜的细胞质侧。其中，MlaC蛋白以其独特的性质脱颖而出：它具有良好的水溶性，分子量仅为23kDa，且每次通常仅结合并运输一种脂质分子，这些特质使得MlaC在研究中更加易于表征。作为Mla系统中不可或缺的一环，研究MlaC的脂质结合偏好、其构象变化及其脂质结合相互作用的性质将有助于更好地了解整个Mla系统的功能。在这篇文章中，作者使用native MS技术，通过碰撞截面分析(Collision Cross Section, CCS)来表征结合和没有结合脂质的MlaC蛋白的构象尺寸变化，使用UVPD鉴定内源性结合脂质，定位脂质结合位点，并根据变温实验和滴定实验确定脂质结合偏好。作者首先表征了与MlaC蛋白结合的内源性脂质。他们在三种E. coli菌株(C43, HM和W3菌株)中表达了MlaC，从每种菌株获得的MlaC的MS1光谱如图1a所示。图中清晰地揭示了一系列不饱和PE和PG脂质的存在。值得注意的是，HM和W3菌株中表达的MlaC蛋白展现出相似的内源性脂质结合模式。相比之下，C43菌株中的MlaC蛋白则呈现出不同的脂质结合特征，其所结合的最丰富脂质种类通过UVPD鉴定为环丙烷修饰的PE(16:0_17:1)。![]()
图 1 W3菌株的MlaC·PG(16:0_18:0)通过UVPD表征，产生大量保留和不保留脂质的离子(图2a),这些离子的模式可以用来定位脂质结合位点(图2b)。作者将脂质固定在MlaC蛋白的不同位置，然后进行序列匹配，发现MlaC蛋白固定在K133位置时，可以得到最高的序列覆盖率84%。以上结果表明，脂质与蛋白质的这一区域相关，这与之前的X射线晶体学、低温电镜结果一致。接下来，作者基于CCSs的测量，监测了源内活化对加合物分布和蛋白折叠结构的影响。碰撞电压超过50 V时，MlaC的天然结构被破坏，这一点可以从MlaC的CCS从2300增加到2700 Å2得到证明(图3b)。然而，直到碰撞电压超过100 V，所有结合的脂质才完全分离，这表明MlaC在所有脂质解离之前去折叠。
探究MlaC对于外源性脂质的结合偏好，是深入理解革兰氏阴性菌中MlaC所介导的选择性脂质转运机制的一个核心问题。在与目标脂质重建之前，使用去垢剂从MlaC中去除结合脂质，然后选择一系列具有不同头基和酰基链数量的脂质进行滴定实验。结果表明，在E. coli中表达的MlaC，其脂质结合特性不受头基种类的影响。具体而言，MlaC倾向于结合那些仅含有一个或两个酰基链的脂质分子，而对于那些拥有三个或四个酰基链的脂质，则几乎不表现出任何结合能力。为了进一步了解MlaC对脂质结合偏好的差异，作者使用变温ESI来监测MlaC·脂质复合物分布随溶液温度的变化。在25 ~ 70℃的温度范围内，脂质结合对MlaC的平均电荷态的影响相对较小(图4a),这表明脂质结合不会显著改变MlaC的构象。此外，MlaC的温度依赖电荷态分布不随脂质种类而变(图4b)，这进一步表明，除了需要一个或两个酰基链外，MlaC几乎没有表现出脂质偏好。
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图 4
综上所述，作者将native MS和UVPD相结合，表征了MlaC蛋白的内源性结合脂质，研究揭示，由C43菌株表达的MlaC蛋白主要倾向于结合含有环丙烷结构的脂质。进一步地，作者利用UVPD技术实现了脂质结合位点的定位。最后通过变温实验和滴定实验说明MlaC蛋白的脂质结合偏好，这种偏好性主要基于脂质的酰基链数量。具体而言，只要脂质分子含有一到两个酰基链，MlaC蛋白便能与之结合，与脂质头基种类无关。Prof. Jennifer S. BrodbeltUniversity of Texas at Austin The Brodbelt group focuses on the development and application of mass spectrometry to a variety of biological problems. They are interested in developing innovative methods for activating ions to generate informative fragmentation patterns, thus improving the structural characterization of proteins, nucleic acids, and lipids. They are also implementing strategies to increase the selectivity of mass spectrometry by incorporation of chromophores or trackable mass tags that allow targeted analysis of complex mixtures.
