脂质在生物过程中发挥着不可或缺的作用,碳碳双键(C=C)影响其结构和功能。不饱和脂质的C=C层面精确表征和定量对于了解脂质生理学和发现疾病生物标志物至关重要。质谱因其高灵敏度、选择性和提供结构信息的能力而成为定位不饱和脂质C=C 键的主要分析方法,现已开发有基于气相离子激发反应和化学衍生化的多种策略,将C=C转化为可裂解基团并利用碎片诊断离子定位C=C位置。然而这些方法常需要特别改造的仪器,或具有差强人意的产率;且对多不饱和脂质会产生多种反应产物,使得结果分析困难,因此对低丰度多不饱和脂质的定量分析存在挑战。来自华南理工大学的周婷课题组开发了微波辅助的六水合单过氧邻苯二甲酸镁(MMPP) 脂质环氧化反应,结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS) 来分析不饱和脂质。微波辐射加速了MMPP环氧化,在10分钟内实现完全衍生化,且无副产物。微波辐射显著促进了多不饱和脂质的环氧化反应,收率大于85%,并产生完全的环氧化产物。通过分析I 型糖尿病模型大鼠血浆中的不饱和脂质,验证了该方法的有效性,糖尿病患者血浆中不饱和脂肪酸增加,而不饱和甘油磷脂减少;此外,Δ9/Δ11异构体对的相对丰度也与糖尿病密切相关。相关工作于今年7月在Analytical Chemistry上发表,题为Efficient Strategy for Characterization and Quantification of Polyunsaturated Lipids by Microwave-Assisted MMPP Epoxidation。
MMPP 是一种商业可得且相对稳定的过氧酸,已被用于有机合成中各种官能团的氧化。对脂质衍生化过程中,MMPP作为氧化剂,在微波促进下,不饱和脂质中C=C键发生环氧化。使用NaHCO3溶液除去过量MMPP后,通过LC-MS/MS 分析+n*16Da的环氧化物,CID中氧杂环碎裂,产生醛和烯一对诊断离子,因此可定位不饱和脂质中的原始C=C 位置。该环氧化方法的实验结果与先前报道环氧化方法的结果一致。对多不饱和脂质,每个C=C均被环氧化,因此在CID中产生对数和C=C数量相一致的诊断离子。但更接近羧基的C=C碎裂产生的诊断离子强度最高,这与先前报道一致,可能是由于该位置碎裂时环状过渡态更稳定、势垒更低。该方法检测限最低可达6 nM,信号随浓度变化的线性回归系数>0.99,说明其具有高灵敏度和准确定量能力。环氧化衍生后的脂质可在常温下稳定保存3小时、4℃下保存1天,更可在-20℃下保存1周。
图1 不饱和脂质在微波辅助下被MMPP环氧化,并在CID中生成诊断离子。
与使用传统加热方法相比,微波辅助反应显著提高了多不饱和脂质的衍生化效率,特别是对磷脂(如PC)。作者认为,磷脂的头基带来的位阻和其中酰基链相互作用带来的位阻,使得对其中不饱和键的衍生化反应更为困难,而微波辐射能够更有效加速分子运动与碰撞,因此可以提高其衍生化效率。微波辅助下的环氧化反应在10分钟内即可反应完全,未检测到明显副产物。
先前研究表明,在多不饱和脂肪酸中,C=C键的环氧化不具有位置选择性。传统的环氧化方法利用单个C=C键的环氧化,形成多种单环氧化产物,必须将所有单环氧化产物的色谱峰面积相加才能实现绝对定量,较为复杂。此外,单环氧化反应通常是通过降低环氧化试剂的浓度来实现的,从而降低了环氧化效率,且即使这样也会不可避免地产生多环氧化产物,不利于定量分析。相比之下,本研究中的微波辅助环氧化策略将所有C=C键环氧化,仅产生单一的全环氧化产物,使多不饱和脂质的定量更为简单。
图2 a-b:相较传统的加热法,微波促进的环氧化反应产率更高。c-d:相较传统的单过氧化法,全过氧化法产生单一的全过氧化产物,峰强度集中,且产物简单易于分析。
先前研究表明,脂质代谢失调在糖尿病的致病机理中发挥重要作用,脂质C=C 键位点异构体组成的变化反映了糖尿病的病理变化。各种血浆脂质可能作为糖尿病风险评估的生物标志物。为体现上述技术的应用能力,作者使用该方法定量分析了I型糖尿病模型大鼠血浆中的不饱和脂质。和先前研究一致,糖尿病大鼠血浆中观察到脂质水平变化,如其中脂肪酸水平上调,且FA 18:1(11Z)、FA 16:1(9Z)(*)、FA 18:2(9Z, 12Z)、FA 18:3(9Z, 12Z, 15Z)和 FA 20:4 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) 显著增加,而PC 16:0/18:1 (9Z)、PC 18:0/20: 4 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) 和LPC 18:1 (9Z)/0:0 的浓度显著降低。SCD1将FA 16:0(*)转化为16:1(Δ9) (*),而ELVOL6将 FA 16:1 (Δ9) (*)延伸至 FA 18:1 (Δ11)。因此,糖尿病大鼠血浆中FA 18:1 (Δ9) 和 FA 18:1 (Δ11)水平的增加可能归因于细胞内SCD1和 ELOVL6酶的活性增强。FA 18:2 (Δ9, Δ12) 是包括前列腺素在内的炎症脂质介质的前体,糖尿病患者血浆中FA 18:2 (Δ9, Δ12) 的上调表明该疾病可能会引起机体的炎症反应。利用该分析方法监测脂质C=C 位置异构体的变化的能力,还可进一步挖掘识别疾病的生物标志物。 例如,所有含 C18:1 的脂质中广泛存在Δ9/Δ11 异构体对。对5 种含 C18:1脂质的分析显示,它们在亚类水平上无明显差异;但在C=C位置异构体水平上,有四个异构体对的比例出现显著变化。例如,LPC 18:1 具有两种主要的C=C 异构体:LPC 18:1 (Δ9) 和 LPC 18:1 (Δ11)。尽管这两种异构体的总量没有显示出显著变化,但两种异构体的相对含量在糖尿病模型鼠血浆和对照组中有显著差异。因此可见,表征不饱和脂质的C=C 位置对糖尿病代谢途径的研究有重要意义。
图3:在不区分C=C异构体时,糖尿病患者血浆中五种脂质水平和对照组无显著差距,但对C=C异构体层面的分析揭示了其中4种的Δ9/Δ11比例有显著差距。
综上所述,本研究开发了利用微波辅助MMPP 环氧化反应与LC-MS/MS 方法相结合,对不饱和脂质进行定量和定性分析的方法。该方法对多不饱和脂质的全部过氧化策略使其定性定量分析简单高效。通过分析I 型糖尿病模型大鼠血浆中的不饱和脂质,发现四个 Δ9/Δ11 异构体对的比例显著变化,证明了该方法在生物学研究中的意义。
审核:乔利鹏
作者信息
周婷博士,副教授,硕士生导师
研究兴趣包括手性药物分析、手性药物立体选择性代谢及手性转化研究、代谢组学、脂质组学、生物样品前处理-色谱质谱联用系统的研发等。
教育经历:2002-2006中国药科大学学士,2006-2008中国药科大学硕士,2008-2011中山大学博士。