今天分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章“Taylor−Aris Dispersion-Assisted Mass Spectrometry for the Analysis of Native Proteins”，通讯作者是来自匈牙利德布勒森大学无机与分析化学系的Attila Gáspár。在蛋白质组学研究中，了解蛋白质在生物过程中的作用对于理解生物体内的酶促反应、调控、分子信号传递、化学运输以及免疫反应中的抗原-抗体识别等至关重要。研究蛋白质的生物学原始构象（三级或四级结构）对于药物设计和医学需求也非常重要。然而，许多分析方法会破坏蛋白质的原始形态。本文介绍了一种新型的Taylor−Aris色散法辅助质谱（TADA-MS）进行非变性质谱分析。传统的电喷雾电离质谱（ESI-MS）由于电离、升温、有机溶剂和酸的存在，通常会破坏蛋白质的原始形态。非变性质谱（native MS）技术通过使用挥发性缓冲液（如pH约为7的乙酸铵）来尽量保持蛋白质的原始状态，但也会引起基质干扰等问题。TADA-MS利用了蛋白质和基质成分（如盐）之间扩散常数的差异，在熔融石英毛细管内的层流条件下实现了大分子和小分子的部分分离，避免了严重的基质干扰问题（图1）。
图1: TADA-MS结果示意图
作者首先分析了雷莫芦单抗（Cyramza）在乙酸铵缓冲液中的结果（图2）。样品的前部区域显示出高质量的质谱信号，表明该区域含有纯净的单克隆抗体。中部区域由于基质干扰（如盐、缓冲液成分和洗涤剂）导致信号抑制，未检测到抗体信号。后部区域的质谱信号也较为清晰，与前部区域类似。
图2 Cyramza的原位TADA-MS分析结果
某些蛋白质在乙酸铵中的稳定性不如在其他缓冲液（如PBS）中好，可能会导致蛋白质变性或聚集。因此作者们进一步测试了马肌红蛋白（myoglobin）、人血红蛋白（hemoglobin）在PBS缓冲液中的结果。作者使用了水动力注射: 使用水动力将样品引入毛细管。注射条件为1 bar压力，持续18秒。这一步确保样品在PBS中被引入毛细管。在样品迁移过程中，使用100 mM NH4OAc（乙酸铵）作为迁移液，压力为1 bar。其中马肌红蛋白的结果如图3所示。样品的前部区域显示出高质量的质谱信号，表明马肌红蛋白以原生形式电离。主要检测到8+和9+电荷状态的马肌红蛋白。中部区域由于严重的干扰未检测到信号，主要干扰来自于PBS中的盐和其他成分。后部区域的信号较弱，可能由于基质成分的拖尾或吸附。在前部和中部区域的质谱图中检测到自由血红素（m/z 616.17），表明在电离过程中可能发生了碰撞激活。
图3 马肌红蛋白的原位TADA-MS分析结果
最后，作者们比较了对刀豆凝集素 A（concanavalin A）在变性条件下的直接注射质谱和在非变性条件下使用TADA-MS进行分析的结果（图4）。在变性条件下，刀豆蛋白A的质谱图主要显示了二聚体和单体形式，没有检测到四聚体形式。在非变性条件下，TADA-MS成功检测到刀豆蛋白A的二聚体和四聚体形式，显示出不同的电荷状态分布。通过源内碰撞诱导解离（isCID），检测到与蛋白质结合的钙离子和镁离子。
图4 刀豆凝集素 A分别使用变性-直接注射MS和TADA-MS分析结果
总之，TADA-MS方法提供了一种直接注射质谱测定生物大分子的方法，显著提高了检测灵敏度，减少了基质干扰，允许在更“原始”的状态下进行蛋白质分析，有进一步探索蛋白-配体复合物的潜力。
编辑：CYL
审核：QLP
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