在多个层面上表征蛋白质，包括一级序列和一系列翻译后修饰到蛋白质折叠、构象以及亚基的排列，在理解生物体中的复杂细胞过程和生物化学途径中起着至关重要的作用。蛋白质的不同构象直接影响它们的功能角色以及与辅因子、底物和许多其他生物分子的相互作用。由于它们的动态性质、受到其他分子的影响以及许多结构状态的瞬时性，表征这些构象面临着重大挑战。离子淌度（IM）根据肽和蛋白质的分子大小、形状和构象进行分离，与质谱（MS）联用可以进一步增强其在复杂生物系统分析的分子数量和范围。近期，德克萨斯大学奥斯汀分校的Jennifer S. Brodbelt课题组在Analytical Chemistry上发表了题为“Conformational Characterization of Peptides and Proteins by 193 nm Ultraviolet Photodissociation in the Collision Cell of a Trapped Ion Mobility Spectrometry-Time-of-Flight Mass Spectrometer”的文章，将紫外光解离（UVPD）与捕获离子淌度谱（TIMS）相结合，研究了蛋白质构象变化导致的串联质谱碎片离子差异，以追踪与蛋白质展开程度相关的碎片模式变化。作者首先使用血管紧张素I 作为模型多肽来优化碰撞池中UVPD的参数，获得了100%的序列覆盖率。为了防止过度激活离子，导致顺序碎片化和产生内部碎片离子，选择了2 mJ能量和2个脉冲作为后续实验的条件。随后，作者使用两种蛋白质，泛素（Ubiquitin）和肌红蛋白（Myoglobin），进行了TIMS-UVPD实验，以评估获得构象选择性碎片的能力。泛素的10+、11+、12+电荷状态均展现出至少三个不同的构象峰，这些峰通过TIMS进行分离。对10+电荷状态的三个构象体进行UVPD分析，发现序列覆盖率从52%到64%不等，且不同构象体的碎片化模式不同，较小构象体（最紧凑）在N端区域有更高的碎片化，而较大的构象体（最伸展）在C端区域有更高的碎片化。泛素中心区域（G35-Q40）在所有构象体中都显示出高效的碎片化，这可能与该区域的灵活性和脯氨酸残基的存在有关（图1）。对肌红蛋白的23+电荷离子的分析，同样观察到三个不同的构象峰。UVPD结果显示，更紧凑的构象体与更延伸的构象体相比，显示出较少的序列覆盖率和碎片离子数量。 作者利用碰撞诱导展开（CIU）改变蛋白质折叠状态，进行了进一步研究。通过改变TIMS的Δ6电压，实现了对泛素6+电荷状态的CIU，观察到电压增加导致蛋白质构象显著变化。在低电压下，泛素保持了较为紧凑的构象，而在高电压下，蛋白质展开，导致中心区域的碎片化增加。CIU曲线显示，随着Δ6电压的增加，蛋白质的碎片化程度增加，表明蛋白质从紧凑状态向展开状态转变（图2）。 综上所述，该研究成功展示了在TIMS-TOF仪器的碰撞池中进行193 nm UVPD的新装置，对泛素和肌红蛋白进行气相分离，观察到了不同构象的离子的淌度特性，反映了它们在大小和形状上的差异。不同构象体的离子在UVPD后产生了不同的碎片化模式，通过CIU对蛋白质进行气相去折叠，其碎片化模式同步发生改变。该策略为研究蛋白质构象变化与碎片化模式之间的相关性提供了新的工具，有助于更深入地理解蛋白质的结构和动态变化。
Prof. Jennifer S. BrodbeltUniversity of Texas at Austin The Brodbelt group focuses on the development and application of mass spectrometry to a variety of biological problems. They are interested in developing innovative methods for activating ions to generate informative fragmentation patterns, thus improving the structural characterization of proteins, nucleic acids, and lipids. They are also implementing strategies to increase the selectivity of mass spectrometry by incorporation of chromophores or trackable mass tags that allow targeted analysis of complex mixtures.
