近期，清华大学化学系瑕瑜课题组在血液中低丰度循环中性鞘糖脂组（nGSLs）分析方面取得了重要进展。相关工作“Selective Enrichment via TiO2 Magnetic Nanoparticles Enables Deep Profiling of Circulating Neutral Glycosphingolipids”已发表在《Analytical Chemistry》上。该文的第一作者为清华大学化学系2020级博士生王紫丹，通讯作者为瑕瑜教授。本课题得到了国家自然科学基金（No. 22225404）的支持。
循环中性鞘糖脂（nGSLs）是由细胞膜脱落并分泌到血液中的两亲性脂质分子，其分子水平的变化与多种代谢紊乱、神经疾病及癌症相关。循环nGSLs可包含1-4个中性己糖单元，不同长链氨基醇和脂肪酰基链的组合可生成数百种分子结构（见图1）。然而，循环nGSLs的整体丰度仅占血浆全脂的0.03%。低丰度水平、低离子化效率以及复杂的结构特性使得其分子种类的鉴定覆盖度低于20%，并且仍未实现脂链修饰和C=C位置等精细结构解析。基于nGSLs丰富的羟基官能团和磁性二氧化钛纳米材料（TiO2 MNPs）的高特异性配位作用，本组开发了一种针对脑组织nGSLs的选择性富集方法，实现了丰度低于3%的脑组织单糖和二糖鞘脂的分离富集(Nat Commun. 2024)。低丰度循环nGSLs对该方法的选择性和nGSLs亚类的覆盖度提出了更高要求。因此，本研究进一步优化选择性富集方法，将选择性提高了10倍，并覆盖了三糖和四糖nGSLs，结合异构体分辨质谱，实现了300余种循环nGSLs的深度结构鉴定。
图1 循环nGSL的代表性结构Hex3Cer 18:2(n-4, n-14);O2/24:1(n-9)及其三个结构单元的其它可能结构。
nGSLs中丰富的羟基官能团在广泛的pH（1.5-14）范围内与TiO2中的Ti(IV)活性位点稳定配位。高丰度磷脂与TiO2之间存在P-O-Ti配位和静电相互作用。P-O-Ti配位作用通常受到重点关注，并采用碱性条件破坏，以移除脂质混合物中的磷脂。然而，我们发现，仍存在40-50%的负电荷磷脂以静电相互作用吸附在TiO2表面的正电荷中心。此前，我们提出使用碱性铵盐洗涤缓冲液，在TiO2表面构筑铵离子的正电荷层，从而破坏静电吸附，两次洗涤去除了脑组织中99%的高丰度磷脂。本文发现，增加碱性铵盐缓冲液的使用次数可进一步提高磷脂的去除率，三次洗涤即实现99.9%的磷脂去除（见图2a），使循环nGSLs的质谱信号成为谱图基峰。此外，研究发现三糖和四糖鞘脂与Ti(IV)之间存在增强的配位相互作用，需要进一步提高其释放效率。我们引入生物特异性的洗脱机制，使用葡萄糖与三糖和四糖鞘脂竞争配位，成功回收超过80%的三糖和四糖鞘脂（见图2b）。该方法可单管处理来自100微升血浆的全脂混合物，循环nGSLs的富集效率达到了40倍（见图2c-d），检测限可达0.25 nM。
图2. （a）提高洗涤次数除去更多高丰度磷脂；（b）葡萄糖辅助释放含寡糖结构的中性GSLs，（c）未经选择性富集和（d）经过选择性富集后人血浆脂质提取物的反相色谱-质谱的基峰色谱图。
本文进一步采用带电荷标记的PB试剂2-乙酰吡啶，对鞘糖脂的C=C结构实施光衍生化，以提高鞘糖脂的分析灵敏度，并在串联质谱中获得C=C及羟基修饰的位置信息和异构体相对含量。整合以上分析流程，本文绘制了循环nGSLs的结构图谱（见图3a），涵盖头基、脂链组成、鞘氨醇结构、酰基链结构、双键及羟基位置等五个结构层级。该方法揭示了大量未被报道的循环nGSLs结构，包括6-OH鞘氨醇、四羟基二氢鞘氨醇nGSLs、奇数链和长链鞘氨醇（C17, C19, C22）nGSLs，以及短脂肪酰基链（C10，C12，C14，C15）nGSLs。值得关注的是，本文首次鉴定了70余种循环nGSLs的C=C位置及羟基位置，发现单/双不饱和循环nGSLs的双键位置均位于n-9和n-6,9，且羟基均位于脂肪酰基链的C-2。选择性富集有效提高了血浆中循环nGSLs的检测限1000倍（见图3b），将循环nGSLs的鉴定数量提升了五倍。
图3. 351种循环GSLs的相对丰度。
总体而言，本研究强调了选择性富集在循环nGSLs深度分析中的广泛适用性和有效性。这一高灵敏分析方法有助于开展分子水平的循环nGSLs研究，以发掘其在代谢及神经系统疾病中的代谢变化。
编辑：王紫丹
审核：王祎纯、周柯汀、瑕瑜
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