近期，英国皇家学会院士Carol V. Robinson及其团队在《美国化学会杂志》（JACS）上发表了题为《Coupling and Activation of the β1 Adrenergic Receptor - The Role of the Third Intracellular Loop》的研究文章。β1肾上腺素受体（β1AR）是G蛋白偶联受体（GPCRs）家族中的一种，其结构特征包括七个跨膜α-螺旋以及连接这些螺旋的细胞内外环。其中，细胞内环3（Intracellular Loop 3, ICL3）在GPCR的经典信号转导与非经典信号转导过程中扮演着重要而独特的角色。通过Native MS、氢-氘交换质谱（HDX-MS）以及时间分辨HDX技术，作者揭示了ICL3在GPCR激活过程中可能通过构象变化调节受体的激活状态，进一步阐明了ICL3在精细调控GPCR功能中的潜在作用。这一研究为理解GPCR信号转导的分子机制提供了新的视角。
G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的一类跨膜蛋白，约有800种不同的受体，依据其结构特征可分为五个主要类别。GPCR的激活和调控机制极为复杂，涉及多个结构特征及配体结合的多样性。所有GPCR都共享七个跨膜域，且跨膜螺旋之间由一系列连接环相连接，这些连接环在配体结合和受体功能中起着至关重要的作用。细胞内环3（ICL3）位于跨膜域5（TM5）和跨膜域6（TM6）之间，且参与了与G蛋白的结合。ICL3在GPCR经典信号转导和非经典信号转导过程中的独特功能。然而，由于ICL3区域的高度灵活性，通常在结构研究中需要去除ICL3，或通过使用如T4L溶菌酶和BRIL等融合蛋白来替代，以增强受体的热稳定性。关于β1肾上腺素受体（β1AR）ICL3的高分辨率结构研究中并未观察到完整的ICL3结构，因此其在G蛋白偶联过程中的具体作用仍不完全明确。本文提出，ICL3可能在GPCR激活的某些步骤中发挥作用，特别是在G蛋白GDP释放和GTP结合的过程中。
作者首先利用native MS研究了两种β1肾上腺素受体（β1AR）构建体（分别为具有和缺失ICL3的β1AR）与mini Gs的结合情况。mini Gs已被报道能够与多种G蛋白偶联受体（GPCRs），包括腺苷A2A受体（A2AR）和β1AR，形成稳定的复合物，并通过别构机制增强受体对激动剂的亲和力。在实验中，作者将缺失ICL3的β1AR与具有完整ICL3的β1AR与mini Gs以及异丙肾上腺素共同孵育20分钟。接着，在能有效检测到未结合状态（apo β1AR）和β1AR_ICL3复合物的条件下，记录了原位质谱数据（图1B）。实验结果表明，β1AR_ICL3与mini Gs的复合物的峰强显著高于缺失ICL3的β1AR与mini Gs复合物的峰强。为了进一步比较两种受体复合物的结合情况，作者计算了未结合受体和复合物的峰强比值（图1C）。由于比较的是峰强比值而非绝对峰强，因此可以排除离子化效率可能引起的偏差。结果显示，β1AR_ICL3:β1AR_ICL3–mini Gs的比值显著高于缺失ICL3的β1AR:β1AR–mini Gs的比值，表明ICL3在β1AR与mini Gs偶联过程中起到了促进作用。
在获得native MS和氘交换质谱（HDX-MS）数据后，作者进一步使用时间分辨氘交换质谱研究ICL3在偶联过程中对GDP结合的影响。通过将氘交换标记时间固定为60秒，作者改变了激活受体与mini Gs孵育的时间（10秒至1小时），并在20°C下进行实验。结果表明，随着孵育时间从10秒延长至20分钟，mini Gs螺旋5的保护效应逐渐增强，并在20分钟后达到饱和（图3A-B），表明可以捕捉到β1AR复合物形成的不同阶段。
为进一步探讨ICL3对GDP释放的影响，作者通过正交荧光检测实验监测β1AR-mini Gs偶联过程中的GDP释放。使用BODIPY FL GDP，研究者比较了缺失ICL3与完整ICL3的β1AR在GDP释放速率上的差异。通过监测荧光强度变化，作者捕捉到了GDP释放过程（图3C）。实验结果显示，在异丙肾上腺素激活后，荧光强度在20°C下随时间衰减，并在约60秒内完成GDP释放（图3D）。Kolmogorov-Smirnov检验结果显示，缺失ICL3与完整ICL3的β1AR在GDP释放初期的曲线分布无显著差异（p值>0.95），表明ICL3的存在与否对GDP释放的初期阶段没有显著影响。
综上，作者提出，β1AR的激活通过激动剂的作用导致与mini Gs的结合，这一过程在ICL3的存在下得到了增强。ICL3通过改变mini Gs螺旋5的结合姿势，促使形成一个更紧凑的结构，并在GDP释放后，通过保护作用稳定偶联。整体而言，这些发现提供了ICL3在GDP释放后稳定偶联并促进cAMP下游信号传导的作用的新见解。研究结果为GPCR的分子内调控提供了新的理解，并对药物设计具有重要的影响。
编辑：苗腾元
审核：黄志辉
Carol V. Robinson
Research Focus
Her research is intrigued by how proteins and their complexes remain stable in the gas phase, guiding their exploration of native mass spectrometry (MS) as a tool to study protein structure, interactions, and dynamics.
