蛋白质高级结构 （HOS） 在蛋白质功能及其与配体和其他蛋白质的相互作用中起重要作用。如何表征蛋白质自然状态下的高级结构仍然具有挑战性。近期，圣路易斯华盛顿大学的Michael L. Gross小组在Anal.Chem.上发表题为“Evaluating Chemical Footprinting-Induced Perturbation of Protein Higher Order Structure”的文章。作者使用特异性氨基酸足迹质谱法表征蛋白质的高级结构，由于这些特异性足迹的反应速度比蛋白质去折叠慢，因此在某些条件下，它们的足迹会引起蛋白质的结构变化，从而导致在非天然结构上进行标记。作者比较了五种方法在完整蛋白质水平上足迹后评估蛋白质 HOS 的有效性，然后进一步在肽水平定位扰动。其中三种是基于 MS 的方法，提供剂量反应图分析、评估前体和产物的泊松分布以及确定平均修饰数。这些基于 MS 的方法可靠有效地指示完整蛋白质水平的 HOS 扰动。这项工作显示了由脚印引起的 HOS 扰动的决定性证据。实施质量控制工作流程可以确定避免扰动的条件，从而准确可靠地识别伴随配体相互作用、突变和溶液环境变化等的蛋白质结构变化。现有几种方法可以表征蛋白质的 HOS，包括核磁共振（NMR）波谱、X 射线晶体学和低温电子显微镜 （cryo-EM）。虽然这些方法可以达到原子级分辨率，但由于结构异质性、样品数量有限以及需要资源密集型数据分析，它们在速度和范围上可能会受到限制。特异性氨基酸足迹质谱通过不可逆地修饰蛋白质的特定氨基酸残基，增加蛋白质的质量，并利用质谱技术进行检测。这种方法具有样品需求量少、速度快、灵敏度高等优点，且能在生物自然液相环境中工作。然而，由于标记反应通常比蛋白质的自然折叠/去折叠过程慢，它可能会在非原生结构上进行标记，从而导致对蛋白质高级结构的错误解析。因此，开发能够准确评估标记后蛋白质结构完整性的方法至关重要。作者首先通过剂量-响应图进行分析，剂量-响应曲线通过测量不同浓度足迹试剂下的反应速率常数（k值）来评估蛋白质结构的完整性。如果蛋白质结构保持不变，则k值应保持不变；若出现扰动，则k值将偏离线性关系。结果显示，对于焦碳酸二乙酯（DEPC）和苯甲酰氟 （BF），剂量-响应曲线在较低试剂浓度下保持线性，随着试剂浓度的增加，曲线出现上翘趋势，表明蛋白质结构开始发生扰动（图1A、B）。接下来作者进行了平均修饰次数分析，平均修饰次数分析通过监测质谱图中所有修饰蛋白峰的质心变化来评估蛋白质结构的完整性。随着试剂浓度的增加，质心应线性增加；若结构发生扰动，则质心增加的趋势将偏离线性（图1C、D）。该方法与剂量-响应曲线分析互补，同样能够有效指示蛋白质结构的扰动。
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作者又引入数学模型对被足迹标记后的蛋白质进行分析，泊松分布模型用于评估足迹产物的分布是否符合独立事件的泊松分布。如果蛋白质结构保持不变，则足迹事件应相互独立，分布应符合泊松分布；若出现扰动，则分布将偏离泊松分布。将泊松分布拟合到从 1 到 100 当量的 DEPC 和 BF 的足迹数据。泊松拟合（实线）与低当量足迹试剂下去卷积 MS 峰的实验强度匹配良好，但随着增加足迹试剂的当量，拟合变得更差（图2以DEPC为例）。这些结果证实，可以从拟合泊松分布来检测扰动。然而，该方法的选择标准（如R²值）具有主观性，且假设每个残基的反应速率恒定为一级反应，这些限制使其在实际应用中可能不如剂量-响应曲线和平均修饰次数分析可靠。
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为了进一步定位扰动发生的具体位置，作者还在肽段水平进行了剂量-响应曲线（图3）和平均修饰次数分析（图4）。结果显示，不同肽段对足迹试剂的敏感性不同，有些肽段在较低试剂浓度下即发生扰动，而另一些肽段则能在较高浓度下保持结构稳定。以用不同浓度DEPC处理肌红蛋白中的Gly1-Glu18和Val28-Glu38肽为例（图3A、B），从图中可知Gly1-Glu18抗扰动能力强，而Val28-Glu38在低浓度DEPC处理下即发生扰动。这种区域特异性的扰动分析为理解蛋白质的高级结构提供了更高的分辨率，并允许研究人员针对特定区域优化足迹试剂的用量。![]()
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本文系统地评估了多种方法在检测化学足迹引起的蛋白质高级结构扰动方面的有效性。结果显示，剂量-响应曲线分析和平均修饰次数分析在完整蛋白质水平上表现可靠，肽段水平的分析则提供了更高的空间分辨率，有助于精确定位扰动发生的区域。在未来的足迹质谱研究中，应采用肽段水平的剂量-响应曲线或平均修饰次数分析来确保蛋白质结构的完整性，从而获得准确可靠的蛋白质结构信息。编辑：苗腾元
Michael L. Gross
Professor of Chemistry and of Immunology and Internal Medicine (School of Medicine)
B.A. (Cum Laude) Chemistry, St. John's Univ. (Minn.), 1962- Ph.D., Organic Chemistry, Univ. of Minnesota
1966 Dissertation Title: "Reactivity of Electron-Rich Aromatics"
Postdoctoral, U. of Penn. (E.R. Thornton), 1966-67 (one year)
Postdoctoral, Purdue Univ. (F.W. McLafferty), 1967-68 (one year)
research interests:
Mass Spectrometry-Based Protein Biochemistry and Biophysics ；Protein Footprinting：fast photochemical oxidation of proteins
