2024年4月，德国达姆施塔特工业大学Frederik Lermyte团队联合8个团队在Nature Methods杂志上发表了题为“Top-down mass spectrometry of native proteoforms and their complexes: a community study”的文章，旨在解决自上而下质谱分析在天然蛋白形态及其复合物研究中的应用挑战。
单一基因可以产生多种不同的蛋白质形态（proteoforms）。近年来，为了准确识别和表征proteoforms，完整蛋白的自上而下质谱（top-down MS）技术发展迅猛。该技术通过测量蛋白质的完整质量，然后进行气相碎裂，获取其序列信息。2021年，人类蛋白质形态项目（the Human Proteoform Project）提出，不仅要关注proteoforms的精确结构，还要表征其与其他蛋白质或配体形成的非共价复合物的相互作用。
传统top-down MS通常在非天然条件下进行，这会导致复合物的结构信息丢失。而native MS保留了非共价复合物的完整性，为研究蛋白质相互作用和复合物化学计量提供了强大工具。然而，尽管native top-down MS技术具有巨大潜力，其应用仍然面临挑战，主要包括标准化不足和实验结果质量评估问题。
为了应对这些挑战，自上而下蛋白组学联盟（the Consortium for Top-Down Proteomics, CTDP）提出了“Native Top-Down Initiative”。该倡议通过全球范围内的多个实验室合作，旨在标准化和推广native top-down MS技术，从而降低研究门槛，并为未来研究提供可靠的基准和方法。
在这项联合研究中，9个实验室使用了总共11台仪器收集数据，包括5台Orbitrap，4台四极杆-飞行时间（QTOF）和2台傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪。在收集数据之前，五名参与者共同创建了一个优化的实验方案，供所有参与者使用。该试验方案见图1，模型蛋白质和获取的数据集见表1。参与者可以自由选择谱图解卷积和碎片归属的方法。
图1 研究参与者使用的native top-down实验方案
表1 模型蛋白质和本研究收集的数据集
研究表明，不同操作员和仪器之间的天然电荷状态分布相对一致，尽管在不同仪器之间存在一些小的差异，尤其是对Aquaporin Z（AqpZ）（图2）。这一结果表明，蛋白质特异性因素主要决定天然电荷状态分布。
图2 不同仪器类型上native proteins的质谱图对比
此外，研究还发现，较大的蛋白质在电离过程中往往保留更多的水和盐，导致有效分辨能力降低。不同仪器的分辨能力存在显著差异，Orbitrap平台通常生成的峰更窄，特别是对于水溶性蛋白质。（图3a）
图3 按蛋白质和仪器类型评估分辨能力和碎裂覆盖率
编辑：乔利鹏
审核：王紫丹
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作者信息
Frederik Lermyte, Assistant Professor, Technische Universität Darmstadt
B.S., University of Antwerp, 2009
M.S., University of Antwerp, 2011
Ph.D., University of Antwerp, 2016
Research Interests: fundamental and applied aspects of native MS, top-down protein analysis, and ion mobility spectrometry.
