Gangliosides是一类含有唾液酸的糖脂分子，位于所有真核细胞膜的外表面，并通过与蛋白质相互作用参与细胞的生命活动。目前，针对gangliosides与蛋白质相互作用的系统性解析仍缺乏有效的分析手段。Ronald Schnaar小组合成了一种双功能化的点击基团-光亲和gangliosides探针，将其运送到细胞膜表面，通过光亲和探针固定与gangliosides相邻（存在相互作用）的蛋白质，随后采用生物正交反应将gangliosides-蛋白复合物分离出来，并进行质谱分析，以鉴定与gangliosides存在相互作用的蛋白质种类。该研究成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.，题为“The Human Ganglioside Interactome in Live Cells Revealed Using Clickable Photoaffinity Ganglioside Probes”。
作者制备了三类双功能gangliosides探针（图1）：通过酰胺化反应将炔烃-diazirine双功能结构引入gangliosides的脂肪酰基链（称为TagB型）。通过氧化-还原-氨化-酰胺化反应将双功能结构分别引入gangliosides的唾液酸糖（site2）和半乳糖（site3）中（称为TagA型）。上述三类探针分别引入了三种哺乳动物中常见的gangliosides亚类：GM3、GM1和GD1a。功能化糖脂探针（浓度<50 µM）由甲基-β-环糊精（浓度<75 µM）携带并运送到细胞表面，孵育1小时后插入细胞膜。该方法在细胞膜中引入了约2.5%的功能化糖脂探针，约为6 nmol/mg蛋白，与细胞膜上原始gangliosides的含量相近。荧光实验证实，TagB型探针嵌入膜内，而TagA型探针的糖基则暴露在膜外。在紫外光（365 nm）下照射10分钟进行交联后，依次进行细胞裂解、引入生物素-叠氮进行点击识别探针、采用亲和素珠子将探针-蛋白复合物分离富集、蛋白酶解、TMT标记及质谱检测。
与不加探针（仅加入环糊精）的空白样本相比，GM3-TagB和GM1-TagB两类探针分别鉴定出887种和1212种与糖脂相互作用的蛋白质。在不同糖类型探针的捕获结果中，发现了蛋白质种类和相对丰度的差异。为进一步验证数据的可靠性，作者使用双功能探针对一个已广泛证实的GM1-霍乱毒素B亚基（GM1-cholera toxin B）的相互作用进行了观测，证实了方法的适用性；此外，作者还采用不含糖结构的神经酰胺双功能探针作为对照，发现其仅捕获到27种蛋白质；在加入外源性、不携带探针的gangliosides进行竞争实验后，观察到糖脂探针对蛋白质的捕获能力下降。
进一步，作者使用在糖上引入双功能结构的探针，并将其整合进细胞中，展开蛋白质的富集分析。结果显示，具有相同糖类型但双功能结构引入位置不同的探针（即在神经酰胺或糖结构上引入）能够捕获不同的相互作用蛋白质。GM1-sia-TagA、GM1-Gal-TagA与GM1-TagB相比捕获到了135种新的蛋白质。GO分析结果表明，这些新鉴定的蛋白质可能来源于糖脂探针对其他细胞表面蛋白的识别和捕获。进一步对蛋白质进行细胞成分分析后，作者发现TagB型探针捕获的蛋白质主要分布在脂筏区域，而TagA型探针则倾向于捕获富含细胞外基质的蛋白质（图2）。
整体上分析，这些被探针捕获的蛋白质功能主要与阳离子和代谢物运输以及细胞粘附相关，符合此前对gangliosides与蛋白质互作的研究结果。该研究进一步发现了此前较少报道的Wnt受体及Wnt信号通路相关蛋白，暗示细胞表面gangliosides的糖结构可能与Wnt信号通路（与癌症相关）存在关联。
图2. a) GM1-sia-TagA、GM1-Gal-TagA与GM1-TagB三类探针捕获的蛋白种类及丰度，f-g）三类探针捕获的蛋白GO分析及细胞组成分析
作者开发的双功能gangliosides探针揭示了多种细胞中gangliosides与蛋白质的相互作用（图3），并通过依赖质谱技术的蛋白组学分析方法对互作蛋白进行了大规模的定性和定量分析，结果与此前报道的相互作用类型一致。该工作流程有望进一步应用于不同糖型gangliosides与蛋白质的互作分析，以观察糖结构在相互作用中的特异性，并发现新的gangliosides-蛋白质互作。此外，该方法也对TagA型探针中糖结构的改造是否会影响其相互作用识别提出了潜在的影响。
图3 神经节苷脂与蛋白相互作用示意图
编辑：Zidan
审核：Wan Wei
请点击推送末尾“阅读原文”查看文章
作者信息
Ronald L. Schnaar
Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Maryland 21205, United States.
Dr. Ronald Schnaar is the John Jacob Abel Professor of Pharmacology and Molecular Sciences and Professor of Neuroscience at the Johns Hopkins School of Medicine.
His team studies glycans and glycan-binding proteins as therapeutic targets in inflammatory diseases, Alzheimer's disease, and ganglioside functions in the brain.
Dr. Schnaar received his undergraduate degree in Cellular Biology from the University of Michigan and his Ph.D. from Johns Hopkins University. He completed postdoctoral training at Johns Hopkins and a fellowship at the National Institutes of Health. Dr. Schnaar joined the Johns Hopkins faculty in 1979.
Dr. Schnaar has served as President of the Society for Glycobiology, Editor-in-chief of the journalGlycobiology, board member of FASEB, and director of the Pharmacology Graduate Program at Johns Hopkins.
His work has been recognized with various honors, including the Karl Meyer Award from the Society for Glycobiology and the Javits Neuroscience Investigator Award from the National Institute of Neurological Disorders and Stroke.
