大家好，今天分享一篇来自日本东京农业科技大学Hiroshi Tsugawa课题组，发表在Analytical Chemistry上的文章，题为“A Procedure for Solid-Phase Extractions Using Metal-Oxide-Coated Silica Column in Lipidomics”。在这项研究中，作者使用二氧化钛/锆涂层的固相萃取（solid-phase extraction, SPE）硅胶柱，分离中性脂、磷脂以及其他脂类，包括脂肪酸（FAs）和糖脂。
由于脂质浓度在生物样本中差异巨大（在人血浆中可达10^8数量级），低丰度脂质常被高丰度脂质信号掩盖，给精确注释和新结构发现带来挑战。基于质谱的脂质组学研究中，脂质富集对提升目标分子的覆盖率至关重要。常用技术包括制备液相色谱（LC）和薄层色谱（TLC），但这些方法耗时，且需针对目标结构优化。固相萃取（SPE）作为常用样品制备技术，尚在脂质组学中较少应用。
在本研究中，作者开发了一种将脂质分为三组的新方法，采用市售单层二氧化硅柱，并在柱表面涂覆二氧化钛（TiO₂）和二氧化锆（ZrO₂）。二氧化锆和二氧化钛对磷酸基团具有较强的化学亲和力，有利于糖脂和磷脂的分离。同时，二氧化硅基质与脂质的极性部分产生静电相互作用，有助于糖脂的富集。作者评估了该方法对甘油脂、鞘磷脂和磷脂的富集效率，并在不同生物样本（如人血浆、小鼠脑、睾丸和粪便）中验证了其可扩展性。
首先，作者优化了分步分离流程。采用己烷、甲苯、氯仿（CHCl₃）、甲醇（MeOH）、甲醇/甲酸（99/1, v/v）、甲醇/水/氨水（80/15/5, v/v/v）、异丙醇/水/氨水（45/50/5, v/v/v）7种溶剂，使用小鼠脑提取物和合成标准品，评估不同脂质种类在不同溶剂条件下与固定相的相互作用（图1a）。最终，作者选择氯仿溶解脂质，在上样馏分中收集中性脂质，包括甾酯、二酰基甘油和三酰基甘油。随后，用甲醇和甲酸（99:1, v/v）通过与金属氧化物表面的Lewis酸位点竞争，回收FAs、神经酰胺及糖脂，包括糖基化神经酰胺和糖基化二酰基甘油。最后，用含5%氨的高含水溶液（IPA/H₂O，45:50, v/v）洗脱与SPE柱强亲和的磷脂（图1b）。在对人血浆、小鼠脑、睾丸和粪便的非靶向脂质组学分析中，证明了与非SPE样品相比，该方法的重复性平均小于10%（图1c），覆盖率约为100%（图1d）。
图1 分步分离流程的建立
尽管样品基质有所不同，但在三种优化溶剂中均实现了高效的脂质分离（图2a）。SPE分离后，酸性MeOH馏分中的脂质检测含量比其他组分低约50倍（图2b）。在富集的酸性MeOH馏分中，共观察到223种脂质，其中包括具有长链多不饱和脂肪酸的HexCer和Hex2Cer，远超未富集馏分的71种（图2c, 2d），单半乳糖基MG（MGMG）和双半乳糖基MG（DGMG）仅在酸性MeOH馏分中检测到（图2e, 2f）。此外，通过将Bligh和Dyer法得到的上层相样品直接加载到SPE柱上并收集IPA/H₂O/NH₃（45/50/5, v/v/v）分馏，成功检测到61种神经节苷脂。
图2 用分馏法进行脂质组分析
综上所述，作者开发了一种基于二氧化锆/钛涂层的硅胶SPE柱的分步分离方法，可有效分离中性脂、磷脂和其他脂类，包括FAs和糖脂。在血浆、脑、睾丸和粪便样本中，该方法实现了80%至120%的脂质回收率。这种逐步固相分离方法不仅有助于减少非靶向脂质组学中的假阳性发现，也对鉴定新的脂质结构具有重要意义。
编辑：王祎纯
审核：王紫丹
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作者信息
Hiroshi Tsugawa
东京农业科技大学，生物技术与生命科学系，副教授
研究兴趣：
计算质谱和计算代谢组学
建立组学（代谢组学、脂质组学、蛋白组学）之间的联系
目前最出名的工作是MS-DIAL和MS-FINDER软件包的开发
