近期，得克萨斯农工大学的副教授Arthur Laganowsky团队在Nature Communications 上发表题为“Native mass spectrometry and structural studies reveal modulation of MsbA–nucleotide interactions by lipids”的文章。MsbA 属于ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)的一种，可以通过促进脂多糖（LPS）前体低聚脂（LOS）从细胞质转运到内膜的周质小叶。目前脂质在调节MsbA-核苷酸相互作用中的机制仍然知之甚少。在这篇文章中，作者通过Native MS 来研究和解析核苷酸和脂质与MsbA 的结合作用机制，证明转运蛋白对ADP具有更强亲和性。此外，与ADP相比 LPS前体KDL可以使 MsbA 对ATP具有更强的亲和性。基于以上研究结果，作者确定了MsbA 的多种结构。在特定脂质存在的情况下，MsbA 填充不同的脂质和核苷酸结合状态。在相似条件下对MsbA的结构研究导致了五种结构的确定，其中一种与KDL结合，NBDs填充了独特的无核苷酸构象。这些结果为了解MsbA 运输周期提供了更多见解。
作者首先对MsbA-核苷酸平衡解离常数进行了测定，应用序贯配体结合模型来推导KDn 。为了确定平衡解离常数KDn （n代表结合n个核苷酸），MsbA 用不同浓度的ATP/ADP 进行滴定（图1e、f）。质谱图显示了一个和两个核苷酸与同源二聚体MsbA 结合的信号（图1a、c）。质谱的反卷积测定MsbA的摩尔分数（ATP/ADP）0–2（图1b、d）。核苷酸结合数据表明MsbA 与 ADP 的亲和力高于 ATP（图1g）。
进一步作者对ADP 和脂质与 MsbA 的结合进行了监测。MsbA 选择性地结合脂质，其中两种最紧密的结合脂质为TOCDL（1,1'，2,2'-四油酰心磷脂）和KDL。基于这两种脂质，确定它们对ADP 与MsbA 结合的影响。向样品中加入 3 μM TOCDL 导致多达4个TOCDL与 MsbA 结合（图2a）。每个TOCDL结合态的ADP分子的丰度没有显著变化，这意味着ADP和TOCDL的结合是独立的。在加入KDL 1μM的情况下，观察到一到三个 KDL 分子与 MsbA 的结合。在MsbA的未结合态和KDL结合态之间，ADP分子的丰度存在轻微变化（图2b）。与两种ADP结合态相比，未与KDL结合的MsbA显示出更高的无核苷酸态丰度。相比之下，三个KDL的结合增强了两个ADP结合状态的丰度。存在相同量的 TOCDL/KDL 但没有 ADP情况下MsbA 的质谱图（图2c，d）显示ADP的结合略微增强了KDL结合。结果表明脂质可以影响MsbA-ADP的相互作用。
图2
随后作者对于脂质和 ATP 与 MsbA 的结合进行了监测。由于ATP的水解导致环境更为动态，使得MsbA与核苷酸的结合更加复杂。作者选择将样品冷藏以监测周转率并减慢反应速度（10 °C 时的活性是 37 °C 时活性的 ~5%）。在加入ATP后立即将MsbA引入质谱仪中，结果显示一个和两个ATP 分子结合，没有 ATP 水解成为ADP（图3上半部）。孵育 30 分钟后，存在对应于ATP或 ADP 结合的 MsbA、两个 ATP 和混合核苷酸的额外峰，特别是 MsbA（ATP）（ADP）（图 3下半部）。这些结果表明，两个ATP分子的水解，每个都与一个单独的NBD结合，不一定同时发生，为独立事件。质谱图显示多达四个TOCDL的结合。添加 TOCDL 的现象与ADP 实验组中观察到类似的结果。在不同的TOCDL结合状态下，一个和两个ATP的丰度是相似的，孵育后，ATP随着ADP结合的出现而被翻转（图3b）。当存在 KDL 而不是 TOCDL 时，出现了明显的区别（图 3c）。在瞬时测量时，一个或多个与MsbA结合的KDL分子的存在显著增强了ATP的结合，特别是当转运蛋白结合三到四个KDL分子时。孵育30分钟后，与两个ATP结合的特定峰的出现变得更加明显（图3c）。较高的KDL结合态主要与ATP结合，这意味着KDL结合增强了MsbA对ATP的特异性。
之后作者使用冷冻电镜对于不同条件下的MsbA 结构进行了成像，通过结构分析为了解MsbA 运输周期提供了更多见解。
综上作者通过对单个核苷酸与 MsbA 结合进行生物物理表征，已经观察到其对 ATP 和 ADP 的亲和力存在差异，发现脂质可以选择性调节MsbA对核苷酸的亲和力。通过Native MS 对于脂质参与整个MsbA 运输周期进行分析，辅以冷冻电镜成像佐证，为深入了解MsbA 运输周期提出了更多的见解。
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