2024年6月，圣路易斯大学James L. Edwards团队在Journal of the American Society for Mass Spectrometry杂志上发表了题为“Double Cyclization Tandem Mass for Identification and Quantification of Phosphatidylcholines Using Isobaric Six-Plex Capillary nLC-MS/MS”的文章，解决了磷脂难以衍生化的问题，发展了6通道isobaric tag标记策略实现对磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的定性定量分析。
磷脂酰胆碱（PCs）和溶血磷脂酰胆碱（LPCs）在细胞膜信号传导、脂肪吸收、细胞通透性、血液凝固和脂蛋白形成中发挥重要作用，并作为癌症、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和代谢疾病的潜在生物标志物受到关注。为了更好地分析这些重要脂质，衍生化-LC-MS策略被广泛开发。目前，已有研究利用衍生化方法区分脂质头基、定位C=C位置以及确定溶血磷脂（lysoPLs）的sn1/sn2位置。此外，还有利用同量异序标签（isobaric tag）实现脂质高通量定量的报道。但是，这些方法仅限于具有反应性头基或双键的脂质。由于缺乏反应性基团，PC的衍生化研究较少。本文作者发展了一种基于伯胺的isobaric tag标记策略，对磷脂头基的游离羟基进行衍生化，实现了肝细胞中PCs/LPCs的定性定量分析。
磷酸基团首先通过DMTMM（4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-1-氧化物）活化，与伯胺基团发生偶联反应，实现了对磷脂的高效衍生化。研究结果表明，该衍生化反应的效率超过99%，未观察到任何反应物或活化中间体的残留。在对衍生化磷脂的MS/MS进行深入研究时，作者发现PC分子在碰撞诱导解离（CID）过程中发生了双环化反应。这种双环化反应是由磷脂分子中的胆碱基团和季铵标记物中的三甲胺基团脱去而形成的。此外，双环化碎片独特的离子特征使其能够作为质量报告离子，用于PCs/LPCs的高通量定量。（图1）
图1 磷酸基团衍生化和双环化气相碎裂示意图
不同的磷脂种类在CID过程中表现出不同的碎片化模式。PCs表现出显著的双环化碎片化特征，而其他磷脂如磷脂乙醇胺（PEs）、磷脂丝氨酸（PSs）和磷脂甘油（PGs）则主要生成标签碎片离子。这一发现表明该标记策略可以有效区分不同类型的磷脂。（图2）
图2 衍生后磷脂的MS/MS谱图
研究团队基于独特的双环化碎裂路径开发了6-plex isobaric tag，实现了高效且精准的定量分析。作者优化了同位素标签原料的选择和标记条件，制备了纯度为83.8%、同位素纯度为90.9%的isobaric tag，尽管起始原料中存在非同位素杂质，但这些杂质未影响定量性能。为验证标签在生物样本中的定量能力，团队采用HepG2细胞中进行标记（1:1:1:1:1:1），结果显示相对强度偏差均在14%以内，这种偏差在生物学重复实验中是常见的。此外，研究还表明，该标签在不同浓度比（1:2:4:10:4:2）的混合样本中也表现出出色的定量精度。（图3）
图3 六通道isobaric tag的定量性能
最后，研究团队将该isobaric tag应用于评估十六烷基磷脂胆碱（HePC）对PC/LPC的影响。HePC是一种已知的PC生物合成抑制剂，通过实验验证，该方法能够有效地识别和量化HepG2细胞中受到HePC处理后的PCs/LPCs变化。共鉴定到17种PCs/LPCs，其中9组在HePC处理后显著下降。（图4）
图4 HePC添加前后HepG2细胞中PCs和LPCs的含量变化
总的来说，James L. Edwards团队的这一研究为PCs/LPCs的定量分析提供了一种全新的工具，有效解决了磷脂难以衍生化的问题，并展示了其在生物样本中高通量定量分析的卓越性能，为脂质组学研究特别是与疾病相关的磷脂代谢变化研究开辟了新方向。
编辑：乔利鹏
审核：万巍
请点击推送末尾“阅读原文”查看文章
作者信息
James L. Edwards, Associate Professor, Department of Chemistry, Saint Louis University
B.A., Saint Louis University, 1999
M.S., Saint Louis University, 2001
Ph.D., University of Michigan, 2006
Research interest: bioanalytical chemistry, separations, mass spectrometry, microfluidics and diabetic complications.
