Nat. Chem.|脒基可降解脂质的快速合成用于体内多功能mRNA递送

学术 2024-07-19 12:58 北京

最近，美国宾夕法尼亚大学Drew Weissman教授团队和Michael J. Mitchell助理教授团队在Nature Chemisrty杂志上发表题为“Fast and facile synthesis of amidine-incorporated degradable lipids for versatile mRNA delivery in vivo”的论文。作者开发了一种基于胺-硫醇-丙烯酸酯共轭的一锅串联多组分反应，实现了快速（1小时）且简便的室温合成脒基可降解（amidine-incorporated degradable, AID）脂质。基于这一简便的合成策略，他们对100种化学结构的AID脂质组合库进行结构-活性关系分析，发现一种尾状胺为烷基苯胺的AID脂质能够作为高效的可降解阳离子脂质增强脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles, LNPs）的内体逃逸和mRNA递送效率。

mRNA疗法在预防和治疗各种疾病方面具有巨大的潜力，而脂质纳米颗粒（LNPs）是目前最先进的非病毒核酸递送系统。LNPs通常由四种成分组成：阳离子脂质、磷脂、聚乙二醇化脂质（PEG-脂质）和胆固醇。其中，阳离子脂质在保护和运输核酸方面起着至关重要的作用，其通常由一个阳离子头基和若干亲脂尾基组成。常见的头基包括胺（从一级到四级）、胍基和氮杂环基团，这些基团在LNP配方中与带负电的mRNA结合，并在内体运输过程中与阴离子膜磷脂相互作用；脂质尾基则影响亲脂性、流动性、融合性和生物降解性，影响LNPs的内体逃逸能力、效力和毒性。以往阳离子脂质通过传统有机合成方法难度大、效率低，不利于大规模筛选，快速简便的阳离子脂质合成方法具有重要意义。

图1 一锅法快速合成AID脂质用于mRNA递送

作者开发的一锅串联多组分AID脂质合成方法快速而简便，将胺、Traut试剂（2-亚氨基硫杂环戊烷）和烷基丙烯酸酯在乙醇溶剂、碱性条件（TEA）和室温下孵育1h即可达到>80%的产率。乙醇作为绿色溶剂，所得溶液可以直接用于LNP配方。从机理上看，伯胺（弱亲核试剂）通过2-亚氨基硫杂环戊烷的亲核开环迅速转化为碱性脒，原位生成硫醇（强亲核试剂），然后立即通过Michael加成反应与丙烯酸酯反应生成AID-脂质（图1a）。

作者将25种胺（包括烷基胺、苯胺和肼类）与四种烷基丙烯酸酯（O9、O12、O14和O16）以组合方式反应，形成100种含脒基和酯键的AID脂质(图1a)。所得的100种AID脂质与DOPE、DMG-PEG和胆固醇以及需要递送的mRNA直接混合就可以得到 100种AID-LNPs进行构效关系筛选（图1b，图2a）。

图2 AID-脂质高通量合成与筛选

为了评估该脂质库的mRNA递送效率并研究构效关系，作者将1-甲基-假尿苷（m1ψ）修饰的荧光素酶mRNA（mLuc）封装到这些LNPs中，并测定其在HepG2细胞中的荧光素酶蛋白表达情况。100种AID脂质中均未显示细胞毒性， 98种AID脂质能够在体外递送mRNA（图2b, c）。其中，23种AID脂质介导的荧光素酶表达达到100,000个单位（高效表达）。作者将对这23种AID脂质进行分析，发现它们是长链（C14–C18）烷基胺、烷基苯胺、二胺或部分聚胺（图2d），而其中烷基苯胺倾向于生成更有效的AID脂质（图2e）。丙烯酸酯部分O14表现最佳（图2f）。接下来，作者探索了AID脂质的体内递送效果。在体外筛选中荧光值超过200,000单位的前8种AID脂质候选物在小鼠中进行了肌肉内注射测试。尽管这8种AID-LNPs在体外显示出相似的效果（图2g），但它们的体内表现却有所不同（图2h），12T-O14被筛选为最佳的AID脂质。实验和理论计算表明结构中的苯环通过协助AID-脂质与阴离子膜磷脂形成更锥形的离子对，增强了膜破坏和内体逃逸能力。

在后续的研究中，将12T-O14作为肝脏亲和性LNPs（MC3 LNP）的补充阳离子脂质，通过简单改变LNPs配方，可以开发具有强效肺部或脾脏靶向性的LNPs，从而实现了肺中的CRISPR-Cas9介导的基因编辑和脾脏靶向的mRNA疫苗递送。

综上，作者基于开发了一种能够快速简便地合成脒基可降解脂质的方法，扩展了阳离子脂质模块化设计和合成的范围，有望加速阳离子脂质的开发和研究，促进mRNA疫苗、蛋白质替代和基因编辑治疗药物的开发。

编辑：简瑞君

审核：乔利鹏

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作者信息

1. Drew Weissman，宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院教授，因在核苷碱基修饰方面的发现使得开发针对 COVID-19 的有效 mRNA 疫苗成为可能，获得 2023 年诺贝尔生理学或医学奖。研究方向主要为mRNA在下一代疫苗、基因编辑和mRNA治疗中的应用。

2. Michael J. Mitchell，宾夕法尼亚大学生物工程系助理教授，他的研究主要集中在开发新型药物递送系统，以改善基因和细胞疗法的效果。

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