鉴别活死细胞是细胞活力评估的关键。然而，目前已开发的具有活/死细胞鉴别能力的超亮CDs通常存在光致发光量子产率（PLQYs）较低和激发波长依赖的缺点。因此，开发具有激发波长无关的荧光发射的超亮CDs用于活/死细胞鉴别成为一项重要任务。2019年，东南大学吴富根教授等以玫瑰红（Rhodamine B, RB）和1, 4-二巯基苯为原料制备了超小（~ 1.6 nm）、超亮（~ 78%）、与无激发波长依赖性的硫掺杂碳点（S-CDs），并证明了S-CDs可以快速（~ 5 min）准确区分几乎所有细胞类型（包括细菌、真菌和动物细胞）的死细胞和活细胞。经证实S-CDs可以快速穿过死细胞表面进入死细胞内部，从而使这些死细胞可视化。相反，S-CDs不能进入活细胞内部，因此不能染色活细胞。总的来说，这项工作开发了一种能够实现几乎所有细胞类型（细菌，真菌和动物细胞）的活/死细胞区分的S-CDs，这是其他荧光纳米探针很少实现的。相关成果于2019年以Rose Bengal-Derived Ultrabright
Sulfur-Doped Carbon Dots for Fast Discrimination between Live and Dead Cells为题发表在Anal. Chem. (IF = 6.7)上，第一作者为东南大学的Yu, Xin-Wang。1. 背景
快速准确地区分活细胞和死细胞在生物学和医学的各个研究领域都是至关重要的。毒物和药物对细胞的影响通常是根据产生的活细胞和死细胞的数量和单个细胞状态来分析的。因此，快速区分细胞的两种状态可以有效地分析这些毒物和药物的功效和作用机制。到目前为止，已经开发了几种典型的方法来鉴定活/死微生物或哺乳动物细胞，例如基于电子显微镜，原子力显微镜，表面增强拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱等。然而，上述大多数技术通常耗时、复杂、费力且昂贵，限制了它们在区分死细胞和活细胞方面的进一步应用。荧光标记技术以其操作简单、响应速度快、灵敏度好等优点受到广泛关注。荧光染色与荧光显微镜配对是快速和灵敏鉴定活/死细胞的最常见方法之一，因为这种方法简单、快速和可见性强。用于选择性染色死细胞的最常用的商业染料之一是PI，因为它只能穿透被破坏的细胞膜并对DNA进行染色。一些活力检测试剂盒，使双色荧光测定细胞活力，通过荧光不同有效的区分不同细胞类型的活和死状态。然而，这些染料中的许多是不稳定和有毒的，需要很长时间的染色处理或在成像前需要清洗。因此，开发一种经济、可靠、快速、免洗、低毒的活/死细胞鉴别试剂是迫切需要的。CDs在生物传感、生物成像、光催化、药物传递等领域有着广泛的应用，在CDs中掺杂不同的元素可以调整它们的带隙并引入额外的缺陷，这可能改变所得到的CDs的光学性质。目前已经开发了大量的方法来获得杂原子掺杂的CDs。硫、氮和/或磷掺杂经常被用来获得具有改进的光学性能的CDs，如更高的光致发光量子产率（PLQYs）、更长的发射波长和更多的官能团，这使得CDs检测活细胞和死细胞成为可能。然而，尽管已经有一些关于使用CDs进行基于荧光成像的活细胞和死细胞区分的报道，这些CDs通常具有复杂的合成过程，低PLQYs和激发波长依赖的荧光发射（这可能导致荧光与其他荧光探针重叠，使双色活/死染色不可能）。更重要的是，大多数报道的CDs只能实现某些类型细胞的活/死荧光区分。因此，开发一种简便的方法来合成荧光强度高、细胞相容性好的CDs，能够实现包括细菌、真菌和动物细胞在内的几乎所有细胞类型的活/死细胞区分，成为一个紧迫的任务。2. S-CDs的制备与表征
如scheme 1所示，1,4-二巯基苯和RB在180 ℃下水热反应4 h制备S-CDs，其绝对PLQY值为74.2%。通过透射电子显微镜对S-CDs的形貌和尺寸分布进行了表征，结果显示S-CDs呈球形，平均尺寸为1.6 nm（图1a）。![]()
Scheme 1.
Schematic Illustration of the Synthesis of S-CDs and Their Application for the
Discrimination between Live and Dead Cells.
Scheme 1. S-CDs的合成及其在活细胞和死细胞鉴别中的应用示意图。
利用傅里叶变换红外光谱研究了S-CDs的表面官能团，发现S-CDs表面存在多种化学基团（图1b）。以~ 3410和~ 2920 cm-1为中心的峰可以分别归因于O−H和C−H的拉伸振动。以~ 2510 cm-1为中心的吸收带来自于S−H的伸缩振动。另外，在1686 cm-1处出现的尖峰可以归为C=O的拉伸振动。1250 ~ 1050 cm-1的吸收峰说明了C−O的伸缩振动的存在，而987、886和726 cm-1的吸收峰分别是S=O、S−O和S−C的伸缩振动。除了FTIR表征外，我们还利用x射线光电子能谱研究了S-CDs的元素组成和官能团。如图S3所示， XPS总谱显示，制备的S-CDs中有C（69.9%）、O（11.1%）、S（11.6%）、Cl（6.1%）和I（1.3%）5种元素。由于Cl和I元素只能来自RB，S元素只能来自1, 4-二巯基苯，所以这三种元素在CDs中的存在验证了两种前驱体之间反应的成功。记录的C1s、O1s和S2p的高分辨率XPS能谱。C1s图谱（图1c）可以拟合成三个峰，分别来自C−C/C=C（284.8 eV）、C−O/C−S（286.0 eV）和C=O（286.7 eV）。O1s区域（图1d）可分为两个峰，分别对应C=O（531.9 eV）和C−O（533.4 eV）。S2p图谱中以163.8 eV和165.0 eV为中心的两个峰（图1e）分别表示存在2p3/2和2p1/2。S-CDs水溶液分散体的紫外-可见光谱在~ 510 nm处有一个吸收峰（图1f），这与S-CDs的荧光激发有关。从图1f的插图可以看出，S-CDs在紫外光照射下具有明亮的绿色荧光。如图1g, h所示，S-CDs的荧光发射与激发无关，最大激发峰和发射峰分别在510 nm和530 nm处。S-CDs的激发-发射等高线图（图1i)和三维荧光图进一步证实了同样的结论。![]()
Figure 1.
Characterization of S-CDs. (a) TEM image of S-CDs. Inset: corresponding size
distribution result. (b) FTIR spectrum of S-CDs. (c−e) High-resolution XPS
curves of C1s, O1s, and S2p of S-CDs, respectively. (f) Ultraviolet−visible
(UV−vis) spectrum of the S-CDs aqueous suspension (20 μg/mL). Insets:
Photographs of the S-CDs suspensions under daylight (left) and UV light
irradiation (right). (g) Fluorescence (FL) emission spectra of the S-CDs
aqueous suspensions (20 μg/mL) collected at various excitation wavelengths. (h)
Fluorescence maximum excitation and emission spectra of the S-CDs aqueous
suspension (20 μg/mL). (i) Excitation−emission contour plot of an S-CDs
suspension (20 μg/mL).
图1. S-CDs的表征。(a) S-CDs的TEM图像。插图：对应的尺寸分布结果。(b) S-CDs的FTIR谱。(c−e) S-CDs的C1s、O1s和S2p的高分辨率XPS能谱。(f) S-CDs水悬液（20 μg/mL）的紫外-可见光谱。插图：S-CDs悬液在日光下（左）和紫外线照射下（右）的照片。(g) S-CDs水悬液（20 μg/mL）在不同激发波长下的荧光发射光谱。(h) S-CDs水悬液（20 μg/mL）的荧光最大激发和发射光谱。(i) S-CDs悬浮液（20 μg/mL）的激发-发射等值线图。
3. S-CDs的生物应用
同时以温度、离子强度、贮存时间和pH为影响因素评价了S-CDs的光致发光稳定性。结果证明，S-CDs具有优异的温度和离子强度稳定性，温度（4 ~ 90 °C）和NaCl浓度（1 ~ 2000 mM）的变化只引起可忽略的荧光波动。另一方面，连续检测了分散在水中28天的S-CDs的荧光，结果表明CDs的水悬浮液具有良好的储存稳定性。且在pH = 1.0 ~ 12.0范围内，S-CDs的荧光强度随pH值的增大而增大，表明S-CDs对溶液pH值具有较高的敏感性。在pH为6.5 ~ 8.0的范围内，S-CDs的荧光强度变化不大，表明其在生理pH范围内具有较高的光致发光稳定性。在pH = 3.0 ~ 6.5范围内，荧光强度与pH值之间存在特殊的关系，这种关系可用于进一步的pH传感应用。选择常见的细菌细胞，包括革兰氏阳性金黄色葡萄球菌细胞（Staphylococcus aureus, S. aureus）、革兰氏阴性大肠杆菌细胞（Escherichia coli, E. coli）、真菌细胞（包括里氏木霉（Trichodermareesei, T. reesei）和酿酒酵母细胞（Saccharomyces
cerevisiae, S. cerevisiae））、癌变哺乳动物A549细胞（人肺癌细胞系）和正常哺乳动物HPAEpiCs细胞（人肺泡上皮细胞系），来评估S-CDs的活/死细胞成像性能。图2a-1的结果表明，在免洗的情况下，S-CDs孵育5 min后，所有类型的死细胞都发出强烈的荧光信号，而活细胞则没有被S-CDs染色。S-CDs可进行活细胞和死细胞的免洗、快速和准确的区分，表明S-CDs有望作为一种通用荧光探针，在不考虑细胞类型的情况下成功区分活细胞和死细胞。还研究了不同时间S-CDs（20 μg/mL）作用后HPAEpiCs和A549细胞的荧光变化，结果显示，随着孵育时间的增加，活细胞和死细胞的荧光变化不大，反映出S-CDs在至少2 h内具有较高的活/死细胞成像稳定性。此外整个观察期内，S-CDs都能清晰地显示出两类细胞细胞核内的核仁，进一步证明了S-CDs对哺乳动物死亡细胞的良好成像质量。S-CDs对死亡哺乳动物细胞的核仁成像能力可能是由于S-CDs在进入细胞后对核仁RNA的高亲和力。此外，细胞毒性评价结果证实了S-CDs具有良好的细胞相容性（图2m-o），表明S-CDs是鉴别活/死细胞的安全探针。![]()
Figure 2. (a−l)
Confocal microscopy images and corresponding flow cytometric results
illustrating the capacity of S-CDs to distinguish between live/dead E. coli, S.
aureus, S. cerevisiae, T. reesei, HPAEpiC, and A549 cells. Before imaging, the
live and dead cells were incubated with the S-CDs at a concentration of 20 μg/mL
for 5 min. Optical density at 600 nm (OD600) values of(m) S. aureus and (n) E.
coli bacterial suspensions treated with various concentrations of S-CDs for
different time periods. (o) Relative viabilities of A549 cells and HPAEpiCs
after treatment with different concentrations of S-CDs for 24 h.
图2. (a−1)共聚焦显微镜图像和相应的流式细胞术结果表明，S-CDs能够区分活/死的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒葡萄球菌、T. reesei、HPAEpiC和A549细胞。成像前，活细胞和死细胞与浓度为20 μg/mL的S-CDs孵育5 min。不同浓度S-CDs处理不同时间的(m) 金黄色葡萄球菌和(n) 大肠杆菌悬液的600 nm光密度（OD600）值。(o) 不同浓度S-CDs作用24 h后A549细胞和HPAEpiCs的相对存活率。
为了进一步探索S-CDs区分死细胞和活细胞的能力，选择了白色念珠菌（Candida albicans, C. albicans）进行额外的测试。图3a共聚焦荧光成像结果显示，所有测试浓度的S-CDs都不能染色活的白色念珠菌细胞，而在不同浓度的S-CDs下可以清晰地染色死亡的白色念珠菌细胞。图3b相应的流式细胞术结果进一步表明，在所有检测浓度下，死亡白色念珠菌细胞内S-CDs的含量都远高于活的白色念珠菌细胞。死亡白色念珠菌细胞荧光强度呈浓度依赖性，S-CDs浓度越高，细菌荧光发射越强。在浓度为20 μg/mL时，死亡的白色念珠菌细胞的荧光已经很明显，因此选择该浓度作为后续实验的浓度。进一步评估了培养时间对S-CDs活/死细胞鉴定性能的影响。如图3c、d所示，死亡的白色念珠菌经S-CDs短时间孵育1 min后，呈现出较强的绿色荧光。随着孵育时间的延长，死亡白色念珠菌的荧光强度变化不大，说明S-CDs具有快速染色死亡细胞的能力。对于活的白色念珠菌，即使孵育时间延长至2 h，也几乎看不到荧光，说明S-CDs对死亡的白色念珠菌细胞具有较高的染色特异性。然后使用PI（一种商用死细胞成像探针）来确认S-CDs的死细胞染色能力。如图3e所示，在合并的共聚焦显微镜图像中可以看到强烈的黄色荧光信号，这表明绿色荧光S-CDs和红色荧光PI具有良好的共定位，也证实了S-CDs可以特异性地显示死亡细胞。![]()
Figure 3. (a)
Confocal fluorescence images of live and dead C. albicans cells treated with
different concentrations of S-CDs for 5 min and (b) corresponding flow
cytometric results. (c) Confocal fluorescence images of live or dead C.
albicans cells treated with S-CDs (20 μg/mL) for different time periods and (d)
corresponding flow cytometric results. (e) Colocalization confocal images of S-CDs
(20 μg/mL) and PI (30 μM) in dead C. albicans cells. (f) Dynamic light
scattering results of DNA, DNA + S-CDs, RNA, and RNA + S-CDs. (g) SEM images of
live and dead C. albicans. (h) Schematic illustration of the live/dead cell
discrimination mechanism of S-CDs. (i) Photostability evaluation results of S-CDs
and PI in C. albicans via confocal fluorescence imaging.
图3. (a) 不同浓度S-CDs处理5 min后白色念珠菌活细胞和死细胞的共聚焦荧光图像和(b) 相应的流式细胞术结果。(c) 用S-CDs（20 μg/mL）处理不同时间段的活的或死的白色念珠菌细胞的共聚焦荧光图像和(d) 相应的流式细胞术结果。(e) S-CDs （20 μg/mL）和PI（30 μM）在白色念珠菌死亡细胞中的共定位共聚焦图像。(f) DNA、DNA S-CDs、RNA和RNA S-CDs的动态光散射结果。(g) 活的和死的白色念珠菌的SEM图像。(h) S-CDs活/死细胞鉴别机制示意图。(i) 利用共聚焦荧光成像技术评价S-CDs和PI在白色念珠菌中的光稳定性。
4. S-CDs的死细胞染色机制
采用真菌DNA和RNA提取试剂盒分别从白色念珠菌细胞中提取DNA和RNA，然后用S-CDs进行孵育。与游离DNA/RNA相比，DNA S-CDs和RNA S-CDs的水动力直径①（通过动态光散射测量）显著增加（图3f），表明S-CDs与DNA/RNA之间存在较强的相互作用。进一步的扫描电镜测试显示，死细胞的细胞表面明显受损，而活细胞的细胞表面保持完整（图3g）。S-CDs的活/死细胞分化机制可以通过两类细胞摄取途径的显著差异来解释（图3h）。在活细胞中，结构和功能完整的细胞表面阻止了S-CDs进入细胞内部，因此活细胞不会发出荧光信号。相反，表面受损的死亡细胞允许S-CDs通过被动扩散快速穿透细胞。内化的S-CDs与DNA和RNA有强烈的相互作用，因此死细胞被荧光S-CDs照亮，实现了活细胞和死细胞的有效区分。此外，文章还比较了S-CDs与工业染料PI的光稳定性。图3i的结果表明，S-CDs比PI具有更高的光稳定性。为了研究不同的死亡方式是否对S-CDs的染色效果有影响，通过不同的处理方式获得死亡的白色念珠菌，然后用浓度为20 μg/mL的S-CDs对细胞进行5 min的染色，结果发现所有细胞都出现了强烈的荧光（图4），表明不同的死亡方式对染色效果没有影响。此外，评估了S-CDs对白色念珠菌的细胞相容性。为了比较，还进行了PI的平行试验。图5结果显示，PI对白色念珠菌细胞的细胞毒性明显高于S-CDs，表明S-CDs比PI具有更好的细胞相容性，保证了S-CDs在生物成像中的实际应用。![]()
Figure 4. Confocal
microscopic images of S-CDs (20 μg/mL)-stained live C. albicans cells and dead
C. albicans cells (which were killed in different ways as indicated).
图4. S-CDs（20 μg/mL）共聚焦显微镜下染色活的白色念珠菌细胞和死亡的白色念珠菌细胞（按图示的不同方式杀死）。
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Figure 5. (a)
Photographs of the agar plates and (b) corresponding statistical results of the
colonies formed by C. albicans treated with various concentrations of S-CDs or
PI for 4 h.
图5. (a) 琼脂平板照片，(b) 不同浓度S-CDs或PI处理4 h后白色念珠菌菌落的统计结果。
5. 总结
本文以1, 4-二巯基苯和RB为原料，通过一步水热合成了超小（~ 1.6 nm）和超亮（PLQY = 78%）的绿色荧光S-CDs，具有免洗、快速（~ 5 min）和准确区分活细胞和死细胞的功能。S-CDs具有良好的水分散性、高的光稳定性和可忽略的毒性。此外，S-CDs可以实现对死亡的细菌、真菌和哺乳动物细胞的通用染色，因此S-CDs可能是区分活细胞和死细胞的通用荧光探针。其染色机制可能是：荧光S-CDs通过受损细胞表面扩散进入死亡细胞，与细胞内DNA/RNA相互作用，而由于细胞壁/细胞膜的屏障，S-CDs无法进入活细胞。与PI等商业探针相比，绿色荧光S-CDs具有更好的生物相容性，适合于细胞成像。文章利用1, 4-二巯基苯和RB为原料制备得到了具有能快速、高灵敏、免洗的区分活/死细胞的S-CDs，将S-CDs开发成一种新的检测试剂是有希望的。在文章的思路上，本文也做到了死细胞的筛选，从不同的细胞到不同的死亡方式，都对以后做活死细胞实验提供了参考。![]()
个人简介：
刘俨漫，23岁，四川广安人；
邮箱：xhu.lym@foxmail.com
